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DNA指导下利用嗜盐碱杆菌Argonaute蛋白进行基因组编辑 2016-06-12 以RNA为指导的核酸内切酶Cas9是现在最常用的基因组编辑工具，它以RNA-DNA杂交的原理特异的切割基因组序列。尽管很多修饰被用于Cas9系统以用来提高该系统的效率和特异性，但是由于它的向导RNA与靶序列的错配以及gRNA二级结构的形成限制了该系统的实用性。 本文主要介绍一种嗜盐碱杆菌的Argonaute蛋白（NgAgo），作为一种核酸内切酶，在向导 DNA（gDNA）指导下能够在人的细胞中进行基因组编辑。NgAgo能够结合大约24个核苷酸的磷酸化的gDNA，它能够位点特异的打断与gDNA配对的双链DNA，NgAgo-gDNA系统不需要PAM序列，相比Cas9,它具有低错配率而且对富含GC的区域也能够高效编辑的优点。 Argonautes是以5‘磷酸化的单链短核苷酸为指导去切割靶位点的核酸内切酶家族，与Cas9相似，Argonautes在基因表达抑制和抵御外来核酸的过程中发挥着重要的作用，然而，Argonautes与Cas9在很多方面是不同的。Cas9只存在于原核生物，Argonautes存在于几乎所有的生物体。Cas9只能切割PAM上游的序列，而Argonautes对靶位点没有特异的序列要求。研究人员认为Argonautes蛋白与gDNA一起可以作为哺乳动物细胞的一种高效、精确的编辑工具。 经研究证明： NgAgo只能结合5’端发生磷酸化的单链gDNA，而不能结合单链gRNA和5’端未发生磷酸化的单链gDNA。而人细胞中存在的5’端发生磷酸化的单链DNA是非常少的，而且即便存在内源性的单链DNA，也不会将NgAgo引导到脱靶位点上。 NgAgo非常忠实于它的初始单链gDNA，与哺乳动物的Ago蛋白相似，不能够在37°C下进行单链gDNA交换。这些特性使得NgAgo最小可能的结合到非目的gDNA。 在哺乳动物细胞中比较NgAgo-gDNA系统和Cas9-sgRNA系统的编辑效率，发现NgAgo-gDNA系统让靶基因失活的效率与Cas9-sgRNA系统一样高。 NgAgo介导的靶DNA切割对gDNA每个位置上的单核苷酸错配非常敏感，任何3个连续位置发生错配会导致完全无法进行切割。 相比于NgAgo-gDNA，Cas9-sgRNA切割HBA2基因和GATA4基因上富含G+C DNA位点的效率要差很多。因此，NgAgo-gDNA系统比Cas9-sgRNA有潜力用于更为宽广的基因组位点。 指导NgAgo的ssDNA只需要满足长度大约24个核苷酸并且5’端发生磷酸化。在本次实验中，研究人员发现gDNA并没有序列的偏好性， 且NgAgo的序列长度只有Cas9的2/3。 Cas9要求gRNA的3’端要有三个发卡结构并且在结合的DNA上附近要有一个PAM序列。而NgAgo的gDNA不需要特异的靶序列并且降低了脱靶率。 NgAgo对基因组编辑的特性有以下几点：首先，它具有低错配率的优势，在研究人员的实验中，单个核苷酸的错配会大大降低NgAgo的切割效率，三个核苷酸的错配几乎完全的阻断切割。第二，在哺乳动物细胞中5’磷酸化的短ssDNAs非常稀少，这样大大降低了细胞内部寡核苷酸错误的引导NgAgo蛋白的可能性。第三，NgAgo忠诚于它的向导，也就是说，一个gDNA可以在NgAgo表达的时候结合上去，而且一旦结合，NgAgo就不能在37℃的条件下再重新结合其他的游离ssDNA。综上可以得出NgAgo具有更小的脱靶率。最后，ssDNA容易设计、合成和调节它的浓度，在Cas9系统中，这些是比较困难的，gDNA的用量仅仅是gRNA的1/10。 总结：