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鲍曼不动杆菌及其耐药基因检测 　　[摘要] 目的 探索一种检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因的新方法。 方法 首先对近几年医院内鲍曼不动杆菌的耐药情况进行分析，选择临床上治疗鲍曼不动杆菌的首选药，再采用聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌及其突变株进行检测。 结果 鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率最低，为9.37%，OXA-51基因扩增结果与细菌培养相符，OXA-23基因扩增与鲍曼不动杆菌耐亚胺培南的结果相符。 结论 采用PCR法对OXA-51基因扩增可以检测是否存在鲍曼不动杆菌，采用PCR法对OXA-23基因扩增可以检测鲍曼不动杆菌是否存在亚胺培南耐药性。从而快速检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因，指导临床用药。 　　[关键词] 细菌；耐药性；聚合酶链反应；鲍曼不动杆菌 　　[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）02-25-04 　　随着抗生素的长期使用，耐药菌不断出现，特别是多重耐药菌的出现已引起社会的广泛重视。2011年初卫生部专门发文要求各级医院重视多重耐药菌的监测。而鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumannii，Ab）是主要引起医院感染的多重耐药菌之一。鲍曼不动杆菌为条件致病菌，可引起多种临床感染，其分离率在非发酵菌中仅次于绿脓假单胞菌，常导致严重的医院感染如菌血症、脑膜炎或肺炎。由于抗生素的过度使用，使得鲍曼不动杆菌产生多重耐药[1-11]，甚至出现了泛耐药株，且耐药性呈逐年上升趋势，已引起人们的关注。 　　鲍曼不动杆菌对青霉素类、头孢菌素、环丙沙星、复方新诺明等耐药率均超过80%，对亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦敏感性较高。目前主要采用培养方法[12]进行检测，而其他检测方法的临床应用还未见。 　　本研究首先对近几年医院内鲍曼不动杆菌的耐药情况进行分析，选择临床上治疗鲍曼不动杆菌的首选药，然后采用聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌及其突变株进行检测，同时采用培养法进行联合检测。以指导临床用药、防治院内感染的蔓延。 　　1 资料与方法 　　1.1 菌株来源 　　从2009年6月～2011年12月本院患者送检的标本（痰液、咽拭子、脓液、尿液、胸水、血液）中共分离到鲍曼不动杆菌32株（经德灵公司AUTO Scan4全自动细菌鉴定系统鉴定确认）。质控菌株包括金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心。 　　1.2 细菌药物敏感纸片 　　哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星均购自英国Oxoid公司。 　　1.3 主要试剂和仪器 　　AUTO Scan4全自动细菌鉴定系统（德灵公司）、ZF紫外透射反射分析仪（上海康华生化器械厂）、Opticon 2 PCR扩增仪器（MJ公司）、GE-100电泳仪（杭州博日公司）。 　　MH琼脂平板、血液琼脂培养基干粉均购自杭州天和微生物试剂有限公司，直接DNA裂解液购自上海申友生物有限公司。 　　1.4 方法 　　1.4.1 主要试剂的配制 （1）10×TBE缓冲液：称取Tris 108g、硼酸55.0g，加入0.5mol/L EDTA（pH 8.0） 20mL定容至1000mL，在室温下储存。工作液为0.5×TBE缓冲液，加蒸馏水稀释20倍即可。 　　1.4.2 细菌的培养、鉴定 按照《全国临床检验操作规程》第3版常规方法进行。根据菌落形态、革兰染色和氧化酶等试验，通过德灵公司的微生物鉴定系统的革兰阴性菌GN卡鉴定为鲍曼不动杆菌。 　　1.4.3 药物敏感试验 采用纸片扩散（K-B）法。根据美国临床实验室标准化委员会（clinical laboratory standards institute，CLSI）2009年标准进行操作和判读结果。 　　1.4.4 DNA的提取 采用蛋白酶K法：挑取血平板上纯培养的单个菌落置入内含无菌生理盐水（50μL）的0.2mL离心管中，浓度约为0.5麦氏单位，加入10μL蛋白酶K（200ng/mL）、50μL直接DNA裂解液，，55℃水浴0.5h，改100℃水浴10min，15000r/min离心30s，移液器吸取上清液。 　　1.4.5 PCR引物引物 OXA-51、OXA-23引物均由上海生工生物技术有限公司合成，扩增产物分别为353 bp 和1036 bp 的DNA 片段， 　　OXA-51基因引物参照郭萍[13]（鲍曼不动杆菌固有基因）： 　　引物1 5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’引物2 5’-TCCATTCCACTTCATCTTGG-3’。 　　OXA-23基因引物参照邹玖明[14]：引物1 5’-GATGTGTCATAGTAT