鳜鱼肌球蛋白重链基因原核表达及多克隆抗体制备.docVIP

鳜鱼肌球蛋白重链基因原核表达及多克隆抗体制备 　　摘　要　肌球蛋白重链（MyHC）是肌肉中的主要结构和功能蛋白，在肌肉收缩过程中起关键作用．根据鳜鱼肌球蛋白重链基因中高亲水性区域DNA设计一对特异性引物，将该基因片段亚克隆到pET32a质粒，构建重组表达载体并转化入大肠杆菌BL21中．诱导条件优化实验结果显示，该菌株经0.8　mmol/L　IPTG诱导3　h可大量表达融合蛋白．将经亲和层析纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体．ELISA和免疫组化测试结果表明：此抗体有较好的特异性和抗原性．鳜鱼MyHC基因表达的研究为深入研究肌球蛋白重链的功能特性及其对肉质性状的影响奠定基础，为提高鱼类肉质提供理论基础和技术支持． 　　关键词　鳜鱼；肌球蛋白重链；原核表达；多克隆抗体 　　中图分类号　Q785 文献标识码　A 文章编号2012　　肌球蛋白是肌肉主要构成蛋白质之一．它由Kuhne于1859年首先报道，之后于1864年在研究骨骼肌收缩时发现并命名［1］．肌球蛋白不仅是基础蛋白收缩系统主要成分，也是一种复杂多聚体蛋白，在真核生物肌肉收缩过程中起到很关键作用［23］．在不同的动物种类之间，乃至鱼类不同品种间，肌球蛋白结构和表达存在着种属间差异性．大部分研究工作主要针对脊椎动物骨骼肌肉（主要是兔和鸡）、心脏肌肉、数种平滑肌而进行，同时也包括部分非肌肉系统肌球蛋白的研究．在鱼类中研究较多的是平滑肌组成的心肌肌球蛋白和横纹肌组成的肌肉肌球蛋白［4］．肌球蛋白不同类型的重链基因全序列克隆测序在多种脊椎动物中已经完成，其中包括大鼠（Rattas　norvergicus）［5］、鸡［6］、人　［7］以及鱼类中的斑马鱼［8］、大头鱼、虹鳟［9］、鲤鱼［10］，大黄鱼［11］和鳜鱼［12］等．因此，对鱼类肌球蛋白分子研究已扩展到不同鱼类品种肌球蛋白重链、轻链的基因克隆分析及其表达．Lied和Decken采用生物化学方法分离提取出虹鳟肌球蛋白重链，并采用此蛋白作为抗原制备出多克隆抗体，鉴定出其结合蛋白［11］．Crockford等［13］和Goldspink等［14］采用哺乳动物cDNA序列为引物从鲤鱼基因文库中克隆出其肌球蛋白重链基因，且证实此类基因表达受环境因子所控制；Kato和Konno测定出鲤鱼重链氨基末端和羟基末端分子结构和调节区域［15］．有关鱼类肌肉特异性基因肌球蛋白轻链（myosin　light　chains，MLC）、肌球蛋白重链（myosin　heavy　chains，MyHC）的cDNA序列分析所获取的数据，为蛋白质和基因结构进化分析提供基础．这些克隆和分离的基因已经用于研制核酸杂交探针，来研究肌球蛋白基因家族转录产物特异性组织表达、进化，以及染色体定位或突变等． 　　湖南师范大学自然科学学报 第35卷第6期 　　刘希良等：鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备本研究旨在通过将鳜鱼肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET32a质粒，构建出重组表达载体，大量诱导表达此蛋白，制备鳜鱼肌球蛋白重链多克隆抗体，为日后分析鳜鱼肌球蛋白重链基因表达对其肉质性状的影响，进而提高鱼类肉质品质提供理论基础和技术支持． 　　1　材料与方法 　　1.1　实验材料与主要试剂 　　体重1　kg　左右的鲜活鳜鱼购买于长沙水产市场，剪腮放血后取背部白色肌肉，-80　℃冰箱保存备用．大肠杆菌菌种BL21（DE3）和DH5α均购于北京天根公司．原核表达载体pET32a为本实验室保存．限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ购于TAKARA公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司；100　bp　Marker、MarkerⅢ、PCR扩增所需的试剂以及一抗AntiHis　Antiboby　和二抗羊抗鼠购于北京天根公司；T4　DNA连接酶、低相对分子质量标准预染及非预染蛋白质Marker购于Fermentas公司；DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于Promega公司；His融合蛋白纯化预装柱购于上海悦克生物科技有限公司．羊抗兔辣根过氧化物酶标二抗、DBA显色试剂盒购于武汉博士德生物公司．其余化学试剂均为国产分析纯． 　　1.2　试验方法 　　1.2.1　引物设计　根据作者已克隆得到的鳜鱼MyHC全长序列（GenBank：HQ829291）及原核表达载体pET32a的载体图谱，利用Primer　Premer5.0软件设计一对引物，其序列分别为： 　　上游引物P+　5′CAGAATTCATGGAAGAGTCCATTGAGGCTG3′（双下划线部分为引入的EcoRⅠ　酶切位点，粗体字为引入的起始密码子）； 　　下游引物P-5′GCGAAGCTTCTAGTTCCTCTTGATTTGCTCC3′（双下划线部分为引入的Hi