蔗糖酶测定方法.docVIP

酶液提取鲜样1g（不同处理天数的第一片真叶或者根系，保存于－80℃ ?加入0.5g pvpP和10mL Hepes冰浴研磨成匀浆（50mMHepes－NaOH pH 7.5缓冲液体系配制1L。Hepes： 11.9150g NaCl： 16.0g KCl： 0.74g Na2HPO4·12H2O：0.543g 葡聚糖： 2g EDTA： 0.3722g MgCl2： 2.0330gDTT： 0.3856gVc： 1.7614g） ?四层纱布过滤 ?12000g，4℃?弃沉淀，留上清液，加5.6g硫酸铵，加入后充分搅动，充分溶解?放置15min，用空管加水与离心管配平?12000g，4℃?弃上清液，沉淀内加入3mLHepes溶解，移到透析袋内?透析袋放到盛有20mL稀释10倍的Hepes ?4℃酶活测定AI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到4.8?加0.2mL（0.1M）蔗糖?加0.2mL酶提取液?37℃?每个试管中加入1mL蒸馏水，空白加2mL蒸馏水?在加1.5mL3,5-二硝基水杨酸（DNS）?520nm比色（比色前混匀）NI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到7.2?加0.2mL（0.1M）蔗糖?加0.2mL酶提取液?37℃?沸水浴5min，流水冷却?每管加21.5mL蒸馏水?520nm比色（比色前混匀）蔗糖合成酶（SS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 果糖（0.05M?加0.1mLUDPG?加0.1mLTris（0.1M）?加0.1mLMgCl2（10mM）?加0.2mL酶液?37℃孵育30min?100℃?加0.1mLNaOH（2N）?沸水浴10min，流水冷却?加3.5mLHCl（30%）?加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀?80℃?480nm比色（比色前混匀）蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 6-磷酸果糖（0.05M?加0.1mLUDPG?加0.1mLTris（0.1M）?加0.1mLMgCl2（10mM）?加0.2mL酶液?37℃孵育30min?100℃?加0.1mLNaOH（2N）?沸水浴10min，流水冷却?加3.5mLHCl（30%）?加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀?80℃?480nm比色（比色前混匀）