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一种新型ATP―依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP 　　摘要：运用基因克隆技术，以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌（Paenibacillus lautus）CHN26菌株的基因组DNA为模板，经克隆鉴定该菌株是一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，全长585 bp，编码194个氨基酸，分子量约为21 ku。采用大肠杆菌（Eschericia coli）pET表达系统构建PlclpP基因表达质粒pET-28-PlclpP，并在大肠杆菌BL21中实现了重组PlClpP蛋白的表达。利用组氨酸标签（His-tag）亲和纯化法获得 PlClpP 纯化蛋白，发现PlClpP可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白复合物。PlClpP复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性，最适反应温度为40 ℃、pH值7.0。表面活性剂强烈抑制PlClpP复合物的酶活性，而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性没有抑制作用。本研究结果为蛋白酶新基因资源的开发、ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。 中国论文网 /1/viewhtm　　关键词：ClpP家族蛋白水解酶；类芽孢杆菌；基因；克隆；表达；酶学特性 　　中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0047-04 　　蛋白水解酶约占全球酶制剂市场的60%，被广泛应用于食品、医药、洗涤剂、农业等领域[1]。微生物是水解酶的主要来源，探索并开发微生物新基因资源，对于解决目前商品化酶制剂种类及来源较少、底物单一、价格昂贵等问题具有重要意义。 　　ClpP（caseinolytic peptidase）家族ATP-依赖型伴侣分子相连（chaperone-linked）的酪蛋白水解肽酶广泛存在于原核生物及真核生物中[2]，其利用ATP驱动蛋白底物解折叠并转位进入蛋白水解腔（chamber）中降解成小分子肽[3]。1988年，ClpP蛋白酶首次被发现于大肠杆菌（Eschericia coli）中[4]。此后的大量研究表明，大肠杆菌中ClpP蛋白酶（EcClpP）由蛋白水解核心ClpP、依赖ATP的伴侣分子ClpA或ClpX组成，其蛋白水解腔由催化位点序列形成的2个反向同型七聚体环构成[2]。在国外，ClpP蛋白酶已商品化，而目前国内尚无涉及ClpP家族蛋白酶的研究报道。此外，有关类芽孢杆菌属（Paenibacillus spp.）中clpP基因功能的研究国内外均无报道。采用基因克隆技术，以笔者所在实验室分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌（P. lautus） CHN26菌株基因组DNA为模板，克隆鉴定了该菌株的一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，并在大肠杆菌BL21中实现了异源表达。本研究结果为ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　Mini BEST细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、Premix Ex Taq Verision 2.0、T4 DNA ligase均购自宝生物工程（大连）有限公司。限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ 购自Promega（美国）公司，Luria-Bertani（LB）培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。卡那霉素、氨苄青霉素、聚丙烯酰胺和N，N′-亚甲双丙烯酰胺等SDS试剂、蛋白质定量检测试剂盒均购自生工生物工程（上海）有限公司。蛋白裂解试剂BugBuster Protein Extraction、纯化试剂Ni-NTA His?Bindresin均购自Merck Millipore（德国）公司。β-酪蛋白购自Sigma-Aldrich（美国）公司。 　　大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21、基因克隆载体pGM-T（Ampr）均购自天根生物技术有限公司；基因表达载体pET-28a（Kmr）购自Merck Millipore（德国）公司；类芽孢杆菌CHN26由笔者所在实验室分离鉴定并保存。 　　1.2试验方法 　　1.2.1分子生物学方法采用Primer 5.0软件（http：///）设计PlclpP基因PCR扩增上、下游引物ClpP-P1f（5′-ATGGAGGATGAAACCATGAA-3′）、ClpP-P1r（5′-TCACAGTTTGGTGACGATGT-3′），以及在5′端分别引入限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切位点（以下划线表示）的上、下游引物ClpP-P2f（5′-CGGGATCCATGGAGGATGA-3′）、ClpP-P2r（5′-CCCAAGCTTCAGTTTGGTGAC-3′）。寡核苷酸引物合成、DNA序列测定由生工生物工程（上海）有限公司完成，基因组和质粒DNA