布氏乳杆菌PG―7去除胆固醇和抗氧化能力研究.docVIP

布氏乳杆菌PG―7去除胆固醇和抗氧化能力研究 　　摘要：从糖蒜中筛选分离到的一株具有降胆固醇和抗氧化能力的产乳酸菌株PG-7，该菌对胆固醇的去除率为581%，对DPPH自由基和超氧自由基的清除率分别为917%和162%。克隆了PG-7的16S rDNA序列，并以其同源性为基础构建了相关属种的系统发育树。结果表明，该菌16S rDNA序列全长1 638 bp，BLAST显示该菌株与乳杆菌属同源；PG-7菌株在进化关系上与布氏乳杆菌属（Lactobacillus buchneri）聚成一族。将其鉴定为布氏乳杆菌属，命名为：Lactobacillus buchneri PG-7。 　　关键词：乳酸菌；胆固醇；抗氧化；系统发育分析 　　中图分类号：Q939.9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0100-04 　　传统发酵食品已成为现代生活重要的健康食品。乳酸菌是发酵食品的最主要菌群，发酵食品的功能与乳酸菌密切相关。乳酸菌也是最重要的益生菌资源，国内外研究表明乳酸菌益生菌菌株具有抗氧化能力和去除胆固醇能力，乳酸菌等益生菌延缓衰老的机制主要是通过改善肠道微生态平衡、清除内自由基实现的[1～6]。张天博等（2007）[7]评价了52株乳酸菌的抗氧化能力，并对其中3株具有较强清除DPPH自由基能力的菌株进行了羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力研究，结果表明，同一菌株对不同种类自由基清除能力不同，乳酸菌的细胞和无细胞提取物对自由基的清除能力亦不同。张江巍等（2005）[8]进行了30株乳酸菌清除DPPH自由基和抗亚油酸过氧化能力的实验，从中筛选出两株抗氧化活性较强的乳酸菌株，并研究了其无细胞提取物对Fe2+螯合能力、超氧自由基和羟基自由基清除能力和菌株SOD活性。糖蒜作为我国传统发酵食品，腌制期间的乳酸菌功能对糖蒜的风味和功能具有重要影响，但有关这方面的报道较少。本实验研究了分离于市售糖蒜的一株产乳酸细菌的体外胆固醇去除能力及抗氧化能力，并进行了系统发育分析，为研究健康食品的作用机制提供了理论依据。 　　1材料与方法 　　11供试材料 　　菌株PG-2、PG-4、PG-7和PG-8从市售糖蒜分离得到，革兰氏阳性，产乳酸，本实验室保存。 　　12菌体及无细胞提取物的制备 　　保藏菌种经过传代活化后，以质量分数为3%接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养18 h，3 000 r/min，离心15 min，收集菌体。离心后的菌体用pH值为74的磷酸缓冲溶液（PBS）洗涤3次，重新悬浮于磷酸缓冲溶液中，调整菌数至109 cfu/ml，用作菌体实验用。将109 cfu/ml菌体液超声波冰浴破碎，细胞残骸于10 000 r/min离心10 min，上清液即为无细胞提取物。 　　13胆固醇去除测定 　　参照Brashears等（1998）[9]的方法，并略有改进。样品预处理：取2 ml培养液，5 000 r/min离心7 min。取1 ml上清于离心管中，加入9 ml无水乙醇，振荡处理5 min，10 000 r/min离心10 min。取2 ml上清加入2 ml P-Fe-S试剂，冰浴混匀反应30 min。测OD550。试验菌种活化后接种于MRS培养基，37℃培养过夜，作为种子液。将种子液接种于含5%蛋黄液的MRS培养基中，每瓶取2 ml用来测定初始培养基中胆固醇含量，37℃培养24 h后再次测定培养基中胆固醇含量，计算胆固醇去除率。 　　14二苯代苦味酰基（DPPH）自由基测定 　　DPPH 溶于无水乙醇，反应时1 ml提取液加1 ml浓度为02 mmol/L的DPPH，室温下静置30 min后，在517 nm处测吸光度变化[7]。 　　DPPH?的清除率（%）=[1- （A1-A2）/A3]×100 　　式中：A1表示未加样品的DPPH 溶液的原始吸光度；A2表示样品在测定波长时的本身吸光度；A3表示加样后DPPH溶液的吸光度。 　　15超氧阴离子自由基（O-?2）测定 　　反应体系包括浓度为150 mmol/L的Tris-HCl（pH82）、浓度为3 mmol/L的二乙三胺五乙酸、浓度为12 mmol/L邻苯三酚和05 ml样品，总反应体积为35 ml。25℃恒温水浴反应10 min，测OD325[8]。 　　O-?2清除率（%）=〔1-（A11-A10）/（A01-A00）〕×100 　　式中： A00为不含样品和邻苯三酚；A01为不含样品，含邻苯三酚；A10为含样品，不含邻苯三酚；A11为含样品和邻苯三酚。 　　1616S rDNA基因的克隆、测序 　　菌株基因组DNA的提取参照《精编分子生物学指南》[10]的方法，略有改动。扩增细菌16S rDNA通用引物：上游P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC