流式细胞术在周期及凋亡中的应用.pptVIP

流式细胞术在细胞周期与凋亡中的应用 上海启因生物 Published journal（sci papers1000) 仪器基本组成 流动室和液流系统 流动室 鞘液SHEATH 激光源和光学系统 光源 滤片 光电管和检测系统 光电倍增管PMT 计算机和分析系统 计算机 液流系统 光路图 周期应用 单参数直方图 DNA细胞周期分析 产品列表 研究领域 分析软件 Modfit: /products/mflt/ Flowjo:/v764/en/cellcycle.html FCS EXPRESS: /site/multicycleplugin.shtml 凋亡研究 在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰。 检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。 细胞凋亡 凋亡检测-每一步都有检测试剂盒 细胞膜变化的检测 磷脂酰丝氨酸（PS）的检测—早期凋亡 早期凋亡PS检测及结果判断 早期凋亡特征 磷脂膜（PS）外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性 DNA没有发生断裂 结果判定 早期凋亡：AnnexinV+/PI- 死亡或者晚期凋亡： AnnexinV+/PI+ 正常的活细胞： AnnexinV-/PI- 线粒体水平检测相关产品 线粒体膜电位的检测 原理：荧光染料JC-1在活细胞中以聚体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光，在凋亡细胞中，以单体形式存在不与线粒体结合而产生绿色荧光。 操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测 JC-1 检测结果流式图 DNA水平的凋亡检测-晚期检测 凋亡晚期 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成~185bp为基数的有序片段 检测方法 Tunel流式法，通过在核酸片段末端标记，跟传统相比优点在于可以计算凋亡百分比 DNA Ladder分析，但凋亡细胞太少时作不到 TUNEL简介 DNA断裂点检测 Antifibrotic effects of ZK14, a novel nitric oxide-donating biphenyldicarboxylate derivative, on rat HSC-T6 cells and CCl4-induced hepatic fibrosis Li?Dai, Hui?Ji, Xiang-wen?Kong and Yi-hua?Zhang 通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）接到DNA片段的3’-OH端，再通过荧光检测定量分析结果。 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling） * * 光学平台 磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。 亲脂性荧光染料JC-1可聚集到健康细胞的线粒体基质上产生红色荧光；随凋亡细胞线粒体膜电位降低，染料以单体形式停留胞质中显示绿色荧光，用绿色荧光增强或减弱判别凋亡的发生 原位缺口末端标记(TUNEL 目 录 01 02 03 工作原理 周期应用 凋亡应用 04 案例分析 概念 流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流动室 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (PE) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL 流动室 激光配置 488nm氩离子激光器 633nm氦氖激光器