浅谈应用流式细胞仪检测cd34 细胞方法学评价.docVIP

使用前删除此我爱浪漫樱花文档主页： HYPERLINK /mtl168168 /mtl168168，分享文档快乐生活快乐无阻PAGE PAGE 1浅谈　　应用流式细胞术(facs)测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞(apbsc)中的cd34+细胞及其亚群，操作简单、快速、重复性好，对及时掌握最佳采集时机，准确判断采集的干 /祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及 apbsc中的cd34+细胞，本文比较了几种 facs检测cd34+细胞方法的异同。 　　1　材料与方法 　　1.1　外周血造血干细胞　apbsc采集自经环磷酰胺（ctx）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhg-csf）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用 cs3000- plus血细胞分离机（baxter公司，美国）。 　　1.2　cd34+细胞的标记　对10份 apbsc分别进行2种不同再处理与cd34标记。 　　1.2.1　溶血法　 apbsc与cd34-pe荧光单克隆抗体（immunotec，法国）室温暗处反应15 min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。 　　1.2.2　 分离单个核细胞法　经ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与cd34-pe标记的单抗室温孵育15 min，待测。 　　1.3　facs检测cd34+细胞　上述标记细胞悬液分为2管，其中一管 6 h内使用流式细胞仪（epics elite esp， coulter公司）测定cd34+细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经 1％多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， facs测定cd34+ 细胞数。 　　1.4　荧光标记的cd34单克隆抗体　33份 apbsc同时分别用表达第2类抗原表位qbend 10（class?,immunotec）和表达第3类抗原表位 8g12（ hpca2，class?，becton dickinson）的单抗进行标记，比较2组 cd34+细胞百分率之间的差异。 　　1.5　双标记cd34/cd45　apbsc中同时加入抗cd45-fitc（j33）和抗cd34-pe（hpca2），用溶血法处理细胞， facs测定cd34+细胞。 　　1.6　统计学处理　用 t检验。 　　2　结果 　　2.1　溶血法与单个核细胞标记法测得cd34+ 细胞百分率无显著性差异（p＞0.50）。 　　2.2　同一样品经 1％多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比，cd34+细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9％～49.5％之间，平均cv值为 32.2％。 　　2.3　apbsc标本分别用2种cd34单体标记，cd34+细胞百分率无显著性差异（p＞0.05）。 　　2.4　cd34-pe／cd45-fitc双标记测定 apbsc中cd34+细胞的百分率为 4.5％，而同一组样品进行cd34+细胞单色标记为5.3％。 　　3　讨论 　　facs虽然对cd34+细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面cd34抗原表达弱且少，标本保存（冷冻）、不同标记方法及固定剂的使用均会影响cd34+细胞结果［1］。本研究对样品固定前、后测定，cv值明显大于批内变异，应在 1％～ 6％，批间变异＜20％的国际质控标准［2］。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高［2］，更适于临床应用。cd34抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定cd 34+细胞，结果是否有差异，则报道不一［3,4］。本研究的结果表明无显著性差异。 　　各实验室对cd34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，lowdell 等对28份 apbsc在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，cd34+细胞为∶ 0.08％～19.31％，cv值为100.1％～136.6％［1］。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会（ishage）成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数cd34+细胞的方法［5］，建议双标记cd34-pe／cd45-fitc计数cd45+细胞中cd34+细胞的百分率，因为白细胞共同抗原cd45在造血干／祖细胞上的表达明显减弱，cd45和侧向散射光（ssc）一起可以较好地把cd34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开［4］。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定cd34+细胞亚群［5］。 　　应用 facs测定cd34+细胞应遵循以下原则∶