蛋白透析时产生地絮状沉淀真地令不少人痛心不已,有时明.docVIP

蛋白透析时产生的絮状沉淀真的令不少人痛心不已，有时明明看了又看，都没发现哪里不对，那么，这其中可能是哪里出现问题，还有这些问题从哪些方面着手解决最合适呢?请看下文分析：蛋白透析产生沉淀可能有以下原因：1.由高浓度的蛋白变性试剂(如8m尿素)，到低浓度，再到不含变性剂的buffer，如果条件变化剧烈，使得蛋白不正确折叠而沉淀，这种情况比较常见。如果选择透析的方法，一定要多加几个中间浓度梯度，而且注意低温(4度)，这有利于蛋白正确折叠。2.透析袋本身有一定的吸附，可以通过磁力搅拌来降低吸附。3.透析液PH靠近等电点，像catzp说的，换buffer。4.透析袋不干净?楼主不会范这种错误吧。或者没认真处理，有杂质、金属离子建议：1 可以采用梯度浓度透析，先采用与你纯化后蛋白盐浓度相近的透析液透析，4-8小时后换更小浓度的盐溶液透析，最后采用生理盐水或HYPERLINK /zt/product/pbs.htmlPBS(pH 7.4)透析。例如：用6M盐酸胍沉淀的目的蛋白，第一步透析可采用4M盐酸胍透析，4-8小时后采用2M盐酸胍透析，再之后可以使用PBS或生理盐水。2 透析液的pH值不要和目的蛋白的等电点接近，这样目的蛋白可能会更容易沉淀。3 保持蛋白浓度在mg/ml量级上面。4 用20mM的醋酸透析也能降低沉淀5 加一些保护剂，如蔗糖，甘油，巯基乙醇等。6 减少脱盐时间。可考虑用超滤或者G系列的凝胶脱盐，这样时间较快，减少蛋白质的变性。7 增加蛋白质浓度也可在一定程度上减少透析过程中蛋白质的沉淀，不过效果不是特别好的。8 最后，不排除是蛋白不稳定的可能性，可在提纯开始时加点甘油，浓度控制在10-25%左右。测序过程常见问题分析与解答1、为什么找不到PCR引物?答：以下几种情况，将无法找到做PCR时的引物序列(1)用PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物(800bp)，可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。(2 PCR产物用T载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当您在一条链上找不到您的引物序列时，试图在互补链上寻找您的引物序列。(3)当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。(4)有时，HYPERLINK /zt/dna/201562.html质粒做模板进行测序时，由于某些原因，HYPERLINK /zt/dna/201562.html质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时自然也找不到引物序列。2、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个最佳的 酶反应条件.如果DNA用缓冲液溶解后,在进行了测序反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。有人溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据经验，推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。3、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好?答：推荐客户提供菌体，由测序公司来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。如果自己提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。4、怎样选择(设计)测序用引物?答：测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3’端的几个碱基能完全配对，即使引物长达80～100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行PCR反应。而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。(1)长度在15～25个碱基左右，一般选择20个碱基(根据GC含量作适当调整)，(2)3’端尽量选择G或C碱基(但不绝对)，以增加与模板的结合能力。(3)Tm温度应选择50℃～7