蛋白酶地检测方法.docxVIP

解析蛋白酶活性测定 聚焦蛋白酶研究新进展1 定义1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/ mL)表示。2 福林法(第一法)2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。2、2、2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。2、2、3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。2、2、4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。2、2、5 盐酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液?(PH=7.5)适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。b、乳酸缓冲液(PH=3.0)适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液 称取乳酸钠(70%)16g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。c、硼酸缓冲溶液(PH=10.5)适用于碱性蛋白酶甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。上述各种缓冲溶液，均须用PH计校正。2、2、7 10g/L酪素3)溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注：3)酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。2、2.8 100ug/mL L-酪氨酸4)标准溶液a、称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/ mL酪氨酸标准溶液。注：4)L-酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。2、3 仪器和设备2、3、1 恒温水浴 40±0.2℃。2、3、2?分光光度计?应符合GB9721的规定。2、4 分析步骤4、1 标准曲线的绘制a、L-酪氨酸标准溶液按表3配制表3管 号酪氨酸标准溶液的浓度ug/ mL取100ug/ mL酪氨酸标准溶液的体积mL取水的体积mL000101101922028330374404655055b、分别取上述溶液各1.00 mL(须做平等试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂使用溶液1.00 mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。4、2 测定(1)待测酶液的制备a、称取酶粉1～2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00 mL)，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用