生物：5.《血红蛋白的提取和分离》学案（2）（新人教版选修1）.docVIP

课题3 血红蛋白的提取和分离一、学习目标：本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。二、重点：凝胶色谱法的原理和方法三、难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。【基础梳理】一、凝胶色谱法 1、概念：也称做 ；是根据 分离蛋白质的有效方法。 2、原理（1）由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的的 。（2）当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。二、缓冲溶液 1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。三、电泳 1、概念：指 在电厂的作用下发生 的过程。2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。 3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。 4、方法：常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。 四、实验操作 1、样品处理:通过 、 、 等操作收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤：目的是 。分离时采取 ，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。 (2)血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：把 离心后，将试管中的液体用 过滤、除去 ，于 中静置片刻后，分离出下层的 。 2、粗分离：即透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析 。 (2)目的：将 的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝胶色谱柱的制作。 (2)凝胶色谱柱的装填 ①材料：本实验使用的是 。 ②方法：凝胶用 充分溶胀后。配成 ，一次性 倒人色谱柱内。不能有 存在；不能发生 流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 ①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。 b、加样：用 小心地将1mL透析后的样品加到 的顶端，注意不要破坏 。 c、加样后：打开下端出口，使样品渗入 内。 ②洗脱：加入 ，打开下端出口，进行 。 4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 。五、操作提示 1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的 用 加热，加速膨胀。 3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低