乙型肝炎病毒cccDNA检测方法和应用价值.ppt

乙型肝炎病毒cccDNA ——检测方法与应用价值 第二军医大学长征医院 缪晓辉　 2005.10 什么是HBV cccDNA? 即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。 设计一对特殊引物：跨双缺口引物　 正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正 链缺口上游 反义引物P2 ：与正链互补结合，位于负 链缺口下游 目的：rcDNA不被扩增 与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。 标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml 阿德福韦治疗48周结果 (2)关于血清中是否存在cccDNA的问题 侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点 优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCR法强 缺点：灵敏度低：104copy/ml 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者分析法（Invader assaay） ?嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 3. 嵌合引物荧光PCR法 Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52 + P N N：与HBVDNA非同源片段 5’ N 5’ 3’ 3’ p + rcDNA cccDNA P N N P2 5’ 3’ 5’ 3’ 3. 嵌合引物荧光PCR法 嵌合引物荧光PCR的优缺点 优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高 缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA被非特异性扩增 无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。 三、影响cccDNA池的因素 1.cccDNA池的自身恒定 ? cccDNA池：感染肝细胞核内HBV cccDNA的 含量在无外来干扰的情况下保 持恒定(5－50copy/cell) ? 病毒自身调节：关于病毒的进化 关于病毒的“思维” 病毒自身的调节 ? 外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果 2.抗病毒药物对cccDNA的影响 现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA 细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性 北京鸭 Delmas等 原代鸭肝细胞 Zoulim等 L-Fd4C 土拨鼠 Dandri等 阿德福韦 北京鸭 Addison等 土拨鼠 Mason等 拉米夫定 原代鸭肝细胞 Schultz等 干扰素 模型 研究者 抗病毒药物 抗病毒药物对cccDNA的影响 （文献举例） Hepatology 2005;42:302-308 举例 3.肝外组织也是cccDNA的储存池？ ·肝外组织细胞中HBV标志的存在情况： 　肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺、PBMC 等组织或细胞中均检测到HBV的标志物 ·HBV吸附？暂居？建立感染状态？ 依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA， 但必须解决检测技术问题 (1)有关PBMCs中cccDNA检测的研究 Hepatol Res 2003 Torii Hepatology 2000 Cabrerizo 未发表 J. Virol 1997 赵克开、郝勇 等 Stoll-Becker PBMCs中存在cccDNA 中华肝脏病杂志 2004 刘茂昌 等 Hepatology 1996 Kock等 PBMCs中不存在cccDNA 发表杂志 研究者 结 论 PBMCs中cccDNA检测结果不一的原因 ·方法学的问题: 假阳、阴性率？灵敏度？ 目前报道阳性结果者均采用套式PCR ！ ·研究模型的选择？ ·病毒因素？ ·细胞数量的多少？ ·其他：免疫功能状态、实验室条件等 (2)关于血清中是否存在cccDNA的问题 · “血清中rcDNA含量越高，cccDNA阳性率 越高和含量越高”的现象，