PFGE原理及注意事项.docVIP

脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。PFGE注意事项：：蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。 冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为:细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。McClelland等[8]通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。同样地,在许多含Ｇ+Ｃ45%的基因组,CCG和CGG更少。这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。(2)紧密相关(closely related):PFGE试验中,其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变,如点突变、插入或ＤＮＡ缺失。典型的情况下,这种变化可导致2～3条带的差异,当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。(3)可能相关(possibly related):两个独立的基因情况所致的一致的差异,如出现了4～6条带差异,此时能用简单的插入或ＤＮＡ缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。这些菌株与暴发株间遗传基因不紧密相关,流行病学上也不大可能相关,在长于6个月时间及大范围的暴发中收集的菌株可出现这类情况。(4)不相关(unrelated):1个分离菌株通过3个更多个独立的基因事件所致的一致的改变,其PFGE图谱与暴发克隆株样式不同,则可认为与暴发克隆株不相关(一般总有7个或更多个条带的差异)。典型情况下,这一分离株常只有少于50%的良好的分离的片段出现在暴发株图谱样式中。