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微生物降解对人参自毒作用缓解效应 　　[摘要] 连作障碍问题严重制约人参生产及土地资源的合理利用，自毒作用是导致连作障碍的关键因子之一。在前期筛选到人参自毒物质降解菌的基础上，研究采用平板培养法和常规生理生化方法测定人参种子萌发的生物学指标和保护性酶活性，以探究自毒物质降解菌对人参自毒作用的缓解效果。研究发现，除棕榈酸外，自毒物质苯甲酸、邻苯二甲酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯和2，2-（4-羟基苯基）丙烷降解液对人参种子生长的毒害作用得到显著缓解，与对照无显著差异。除苯甲酸外，其余自毒物质降解后人参SOD，POD，CAT酶活性均较降解前显著降低。研究结果表明，微生物降解是缓解自毒物质抑制人参种子萌发的有效途径，该发现将有助于人参连作障碍问题的解决。 　　[关键词] 人参；自毒物质；降解菌；种子萌发；酶活性 　　[收稿日期] 2013-12-23 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目81373911） 　　[通信作者] 丁万隆，Tel：（010E-mail：wlding@；赵东岳，Tel：（010E-mail：zhaodongyue1987@126.com 　　[作者简介] 李勇，Tel：（010E-mail：liyong@ 　　人参Panax ginseng C. A. Mey.为五加科人参属药用植物，主产我国东北地区长白山麓。目前，市售人参主要依赖人工栽培，连作障碍是困扰人参规范化种植的最突出问题。据报道，自毒作用是造成人参连作障碍产生的主要根源之一[1]。深入研究发现，距离人参根系越近的土壤，甲醇提取物对人参种子萌发的抑制作用越强，新开垦的林地土则基本无抑制作用[2]。通过化学分析，进一步从人参栽培土壤中分离、鉴定了多种对人参种子萌发及生长具有明显抑制作用的化学成分，其中部分化合物是国际公认的化感物质[3-5]。本课题组从六年生人参根围土中筛选出5种能够高效降解人参自毒物质的细菌菌株，液体培养状态下均能以人工添加的自毒物质作为唯一碳源生长，在7 d内对自毒物质的降解率接近80%[6]。在此基础上，本文通过对人参种子胚根、胚轴生长情况以及SOD，POD，CAT酶活性的测试分析，进一步明确了微生物降解对人参自毒作用的缓解作用。本研究不仅有助于揭示自毒物质降解菌对人参自毒作用的缓解效果，同时也为降解菌在生产中的合理应用提供参考依据。 　　1 材料 　　经过后熟处理的人参种子购自吉林省抚松县万良镇。人参种子先用自来水冲洗干净，再用1 000倍多菌灵可湿性粉剂处理15 min，自来水反复冲洗多次，25 ℃恒温培养箱黑暗保湿培养2 d，选择出芽一致、颗粒饱满的人参种子开展自毒效应缓解研究。分别将自毒物质降解菌接种至LB液体培养基，37 ℃，120 r?min-1震荡培养24 h。取10 μL种子液接种至含100 g?L-1自毒物质的基础盐培养基中，37 ℃，120 r?min-1恒温震荡培养14 d，降解代谢液4 ℃冷藏，备用。 　　2 方法 　　2.1 自毒物质溶液的配制 苯甲酸（A）、邻苯二甲酸二异丁酯（B）、丁二酸二异丁酯（C）、棕榈酸（D）和2，2-（4-羟基苯基）丙烷（E）购自国药集团化学试剂北京有限公司。分别称取5 g自毒物质，溶于50 mL无水乙醇，配制成质量浓度为100 g?L-1的母液，备用。基础盐培养基包括：（NH4）2SO4 2 g，MgSO4?7H2O 0.35 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，NaH2PO4 0.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。分别将自毒物质降解菌的单菌落接种至LB液体培养基，37 ℃，120 r?min-1震荡培养24 h。取10 μL接种在含自毒物质（100 mg?L-1）的基础盐培养基中，37 ℃，120 r?min-1恒温震荡培养14 d，降解液4 ℃冷藏，备用。 　　2.2 生物学测定 分别将5 mL自毒物质降解液以及1 mg?L-1（低浓度），10 mg?L-1（中浓度），100 mg?L-1（高浓度，阳性对照）自毒物质的无机盐培养液加入底部含2层吸水滤纸的玻璃培养皿（Φ9 cm）中，均匀摆放10粒事先灭菌的人参种子，每种处理3次重复。以不加自毒物质的无机盐培养液作为阴性对照。将上述处理在培养箱中25 ℃恒温避光培养10 d，期间添加无菌水保湿[6]。测量种子胚根和胚轴长度，并计算抑制率（I），抑制率I=（处理-对照）/对照×100%。“+”表示抑制作用，“-”表示促进作用。 　　2.3 酶活性测定 取0.2 g人参幼苗，加入5 mL预先配好的磷酸缓冲液（pH 8.0），冰浴研磨，4 ℃，1万r?min-1离心15 min，收集上清液，用于酶活性测定。超氧化物歧化酶（SOD）酶