生化物质分离纯化技术.pptVIP

生化物质的分离纯化技术 生化物质分离纯化技术包括：生化产品的分离分析和生化产品的制备。 生物产品的制备中的分离方法多采用温和的“多阶式”方法进行，即常说的“逐级分离”方法。 一、分离纯化原理 （1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心，膜分离（透析、 电渗析）与超滤法，凝胶过滤法。 （2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。 （3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。 （4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。 （5）根据配体特异性进行分离——亲和层析法。 二、分离纯化的程序和生产设计 （1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法； （2）制备物的理化性质稳定性的预备试验； （3）材料处理及抽提方法的选择； （4）分离纯化方法的摸索 （5）产物的均一性测定。 1．分离纯化初期使用方法的选择 早期分离方法的选择原则是从低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大者为合适，用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。 2．各种分离纯化方法的使用程序 生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要根据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。 在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率，如在盐析后采取吸附法，必然会因离子过多而影响吸附效果，如增加透析除盐，则使操作大大复杂化。如倒过来进行，先吸附，后盐析就比较合理。 3．分离后期的保护性措施 在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气的氧化和某些事先无法了解的因素。 三、分离纯化方法的评估 每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑外，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。 四、生化产品纯度的鉴定 一个制备物是否纯，常以“均一性”表示。均一性是指所获得的制备物只具有一种完全相同的成分，均一性的评价常须经过数种方法的验证才能肯定。 生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法，化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法等。 五、具体分离纯化方法 （一）沉淀法 （二）膜分离法 （三）层析法 （四）电泳法 （五）离心技术 （一）沉淀法 在生化药物制备中最常用的几种沉淀方法是： ⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 ⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。 ⑶等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 原理 1）中性盐离子破坏蛋白质表面水膜 。 2）中性盐离子中和蛋白质表面电荷 盐析常用的盐 常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸二氢钠等。实际应用中以硫酸铵最为常用。 因为硫酸铵具有: ①盐析能力强。 ②溶解度大且受温度影响小。 ③不易使蛋白质变性。 ④价格价廉 影响盐析的因素 盐饱和度：不同的蛋白质，其结构和性质不同，盐析时所需的饱和度也就不同。 蛋白质浓度：一般常将蛋白质浓度控制在2～3％为宜。 pH：进行盐析时的pH，要选择在被盐析的蛋白质的pI附近。 温度：蛋白质的盐析一般在室温下进行 盐析操作（以硫酸铵为例） 1. 操作方式 盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式： （1）加硫酸铵的饱和溶液 在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。 （2）直接加固体硫酸铵 在工业生产溶液体积较大时，或需要达到较高的硫酸铵饱和度时，可采用这种方式。 操作注意事项 (1)加固体硫酸铵时，必须注意表中的温度。 (2)分段盐析时，要考虑到每次分段后蛋白质浓度的变化。 (3) 盐析条件如pH、温度和硫酸铵的纯度都必须严格控制。 (4) 盐析后一般要放置0.5～1h。 (5) 盐析过程中，搅拌必须规则和温和。 (6) 反应至少应在50mmol/L缓冲溶液中进行。 2、有机溶剂沉淀法 概念：利用有机溶剂能降低蛋白质等生物大分子在水溶液中的溶解度的原理而使之沉淀析出的方法，称为有机溶剂沉淀法。 基本原理 1）有机溶剂能降低水溶液的介电常数。 2）有机溶剂能破坏蛋白质表面的水膜。 常用的有机