流式细胞仪培训(课件).ppt

流式细胞仪的临床应用 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 * 补偿调整实验 * 藻类细胞绝对计数 * 细胞周期分析 DNA含量分析-PI染色 * * 细胞凋亡 细胞膜分析-PS外翻 PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合 * 细胞凋亡 * 细胞生理学研究 Ca2+流动性检测 Ca2+ 是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。 最常用的染料 Indo-1 excited at UV Fluo-3 excited at 488nm Fura red excited at 488nm * 细胞生理学研究 细胞活性分析 Fluorescein Diacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光 * 细胞生理学研究 细胞膜电位的改变 超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。 染料和试剂 DiOC6(3) DiOC5(3) DiOC1(3) DiOC1(5) Valinomycin Gramicidin D CCCP * 细胞内标记 胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase. 胞内细胞因子 磷酸化蛋白 * * 流式细胞仪原理与应用 陈玉婵 * 提 要 流式细胞仪简介 流式细胞仪工作原理 流式实验流程 流式细胞术的应用 * 流式细胞术的发展史 1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。 * 什么是流式细胞仪？ 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器 仪器特点：单个细胞通过狭窄激光束，产生能够反映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分能发射出不同的荧光。 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid * 流式细胞仪的检测对象 藻类细胞 染色体 血细胞 原生动物细胞 任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析 * 流式细胞仪工作原理示意图 流式的基本组成： 1.流动室和 液流系统 2.光路系统 3.电系统 * 流式细胞仪可提供的信息 物理信息：通过散射光信号反映 相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 荧光信息：通过荧光强度反映 * 散射光信号的产生 488nm激光产生散射光 * 1. 散射光信号 前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号 反映细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射激光90?角的散射光信号 反映细胞粒度及细胞内相对复杂性 * 散射光 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 通常使用“散点图”来看散射光信号 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据 * 利用散射光信号对混合细胞分群 * 2. 荧光信号 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 * 荧光信号的表示方法 双参数点图 单参数直方图 * 一个完整流式实验的组成 样品的处理 调整仪器条件 数据处理 * 1.样品处理 单细胞悬液的制备 浓度5?105?1 ?106/mL 外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液 选择合适的荧光染料染色 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 * 2.仪器条件的确定 电压 阈值 荧光补偿（多色分析） * 处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电