实验十血清蛋白地醋酸纤维薄膜电泳.ppt 30页

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  • 2018-07-13 发布

实验十血清蛋白地醋酸纤维薄膜电泳.ppt

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    实验十血清蛋白地醋酸纤维薄膜电泳

    实验十 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 1 实验目的 ⑴ 了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术; ⑵ 掌握测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量; 2 实验原理 醋酸纤维薄膜电泳(cellulose acetate membrane electrophoresis)以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯,由纤维素的羟基经乙酰化而成。 它溶于丙酮等有机溶液中,即可涂布成均一细密的微孔薄膜,厚度约0.1-0.15mm为宜。太厚吸水性差,分离效果不好;太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物,分离各种血清蛋白。 血清中含有清蛋白,α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同,在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性PH值缓冲体系中,带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。 例如,以醋酸纤维素薄膜为支持物,正常人血清在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右,染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快,其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白(如图3-5)。 图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白,2,3,4,5分别α1-,α2-,β-及 γ-球蛋白,6为点样原点 这些区带经洗脱后可用分光光度法定量,也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。 此法由于操作简单,快速,分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白,还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。 3 实验器材与试剂 3 实验器材与试剂 ⑴ 器材 ⑴ 器材 电泳仪及电泳槽(包括直流电源整流器和电泳槽两个部分,电泳槽用有机玻璃或塑料等制成,它有两个电极,用白金丝制成。);醋酸纤维素薄膜(2×8cm);培养皿(直径9-10cm);解剖镊子竹夹子;点样器;直尺和铅笔;玻璃板(12×12cm);试管若干及试管架;吸量管(2mL,5mL);可见光分光光度计;吹风机;单面刀片;普通滤纸及臭氧化缸(可用普通容器代替) ⑵ 试剂 ⑵ 试剂 ① 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6, 0.07mol/L, 离子强度0.06) 称取1.66g巴比妥(AR)和12.76g巴比妥钠(AR),置于三角烧瓶中,加蒸馏水约600mL,稍加热溶解,冷却后用蒸馏水定容至1000mL。置40C保存,备用。 ② 血清蛋白染色 染色液(0.5%氨基黑10B):称取0.5g氨基黑10B,加蒸馏水40mL,甲醇(AR)50mL,冰乙酸(AR)10mL,混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。 漂洗液:取95%乙醇(AR)45mL,冰乙酸(AR)5mL和蒸馏水50mL,混匀置具塞试剂瓶中贮存。 ③透明液:临用前配制。 甲液:取冰乙酸(AR)15mL,无水乙醇(AR)85mL,混匀置试剂瓶内,塞紧瓶塞,备用。 乙液:取冰乙酸(AR)25mL,无水乙醇(AR)75mL,混匀置试剂瓶内,塞紧瓶塞,备用。 ④保存液:液体石蜡。 ⑤定量洗脱液(0.4mol/L NaOH溶液): 称取16g氢氧化钠(AR)用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。 4 实验方法与步骤 4 实验方法与步骤 ⑴ 仪器与薄膜的准备 ⑴ 仪器与薄膜的准备 ① 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 用竹夹子取一片薄膜,小心地平放在盛有缓冲液的平皿中,若漂浮于液面的薄膜在15-30s内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳;若薄膜润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点等,则表示薄膜厚薄不均匀应弃去,以免影响电泳结果。 将选好的薄膜用竹子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约30min后,方可用于电泳。 ② 电泳槽的准备 根据电泳槽膜支架的宽度,剪裁尺寸合适的滤纸条。 在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放两层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。 滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,因而称为滤纸桥。 ③ 电极槽的平衡 用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽,使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态,一般需平衡15-20min。注意,取出平衡装置时应将活塞关紧。 ⑵ 点样 ⑵ 点样 取一张干净滤纸(10×10cm),在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线,此线为点样标志区。 用竹夹子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上,使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时,先用玻璃棒或血色素吸管取2-3μL血清,均匀涂在加样器上,再将点样器轻轻印在点样区内,如图3-6所示,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、

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    • 内容提供方:jyf123
    • 审核时间:2018-07-13
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