实验十血清蛋白地醋酸纤维薄膜电泳.ppt

实验十 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 1 实验目的 ⑴ 了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术； ⑵ 掌握测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量； 2 实验原理 醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。 它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约0.1-0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。 血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。 例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白（如图3-5）。 图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及 γ-球蛋白，6为点样原点 这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。 此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。 3 实验器材与试剂 3 实验器材与试剂⑴ 器材 ⑴ 器材 电泳仪及电泳槽（包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽用有机玻璃或塑料等制成，它有两个电极，用白金丝制成。）；醋酸纤维素薄膜（2×8cm）；培养皿（直径9-10cm）；解剖镊子竹夹子；点样器；直尺和铅笔；玻璃板（12×12cm）；试管若干及试管架；吸量管（2mL，5mL）；可见光分光光度计；吹风机；单面刀片；普通滤纸及臭氧化缸（可用普通容器代替） ⑵ 试剂 ⑵ 试剂 ① 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6, 0.07mol/L, 离子强度0.06) 称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600mL，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。置40C保存，备用。 ② 血清蛋白染色 染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40mL，甲醇（AR）50mL，冰乙酸（AR）10mL，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。 漂洗液：取95%乙醇（AR）45mL，冰乙酸（AR）5mL和蒸馏水50mL，混匀置具塞试剂瓶中贮存。 ③透明液：临用前配制。 甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 ④保存液：液体石蜡。 ⑤定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）： 称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。 4 实验方法与步骤 4 实验方法与步骤⑴ 仪器与薄膜的准备 ⑴ 仪器与薄膜的准备 ① 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15-30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。 将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳。 ② 电泳槽的准备 根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。 在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。 滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。 ③ 电极槽的平衡 用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15-20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。 ⑵ 点样 ⑵ 点样 取一张干净滤纸（10×10cm），在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。 用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取2-3μL血清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内，如图3-6所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、