第六章水产动物病原地检测技术.ppt

第六章 水产动物病原的检测技术 第一节 免疫学检测 第二节 PCR技术 第三节 核酸分子杂交技术 第一节 免疫学检测 一、 Ag-Ab反应的一般规律和特点 二、 Ag-Ab反应的影响因素 三、免疫凝集试验 四、免疫沉淀试验 五、与补体相关的试验 六、酶联免疫吸附试验 七、荧光免疫技术 一、Ag-Ab反应的一般规律和特点 （一）特异性与交叉性 （二）可逆性 （三） Ag-Ab的结合比例与“带现象” （四）特异性结合与反应可见两个阶段 二、影响Ag-Ab反应的主要因素 1、电解质：生理盐水（0.85%NaCl ） 2、温度：37℃，水产动物28～30℃ 3、PH：6~8 三、免疫凝集试验（凝集反应） 　　　　　　 电解质 颗粒性Ag + 相应Ab 凝集小块 （凝集原） （凝集素） 反应种类 敏感度 直接凝集反应 + 间接凝集反应 ++ 间接凝集抑制试验 +++ 协同凝集试验 +++ （二）间接凝集试验 可溶性Ag吸附在载体表面 + Ab → 凝集 （致敏颗粒） 可用来检测微量存在的Ab 载体：红细胞--------------------------间接血凝试验 聚苯乙烯乳胶颗粒-----------间接凝胶凝集试验 硫酸铝、活性炭 （三）间接凝集抑制试验 可溶性Ag + 相应Ab + 相应致敏颗粒→不出现致敏颗粒凝集 可用来检测可溶性Ag 如：免疫妊娠诊断试验： （1）诊断Ag：HCG致敏的乳胶颗粒 （2）诊断血清：抗HCG的Ab （3）检测标本：尿液（是否含有HCG） （四）协同凝集试验 金黄色葡萄球菌细胞壁中的蛋白A（SPA） SPA+IgG→暴露Fab片段+相应Ag→协同凝集反应 通常可用于检测可能存在的微量抗原 目前，已用于流脑、伤寒、布氏菌病的早期诊断 四、免疫沉淀试验（沉淀反应） 可溶性抗原 + 抗体 肉眼可见的沉淀 （沉淀原）（沉淀素） （一）环状沉淀试验 已知抗血清+待检抗原 液面交界处，白色环状沉淀 主要用于抗原的定性试验，如细菌血清型鉴定等。 （二）琼脂扩散试验 可溶性Ag+相应Ab 白色沉淀线 琼脂扩散：双向、单向 琼脂扩散+电泳技术： 对流电泳、火箭电泳、免疫电泳 1、双向琼脂扩散 单个Ag-Ab系统 多个Ag-Ab系统 五、与补体相关的试验 （一）溶解试验 1、溶血试验 红细胞与相应抗体（溶血素）结合，通过激活补体使红 细胞溶解 2、溶菌试验 某些细菌与相应Ab结合，可激活补体，使细菌溶解 （二）补体结合试验（CFT） 是一种在补体参与的条件下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来测定有无相应抗原或抗体的血清学试验。 （一）直接法 抗原（抗体）+ 酶标抗体（抗原） 七、免疫荧光技术 又称荧光抗体技术。 荧光素： 异硫氰酸荧光素（FITC）----------------黄绿色荧光 四乙基罗丹明（RB200）------------------橙色荧光 四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）---橙红色荧光 一、定义 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）： 在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件 下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。 二、反应体系和过程 1、PCR反应缓冲液 2、模板DNA 3、引物 4、Taq DNA聚合酶 5、4种脱氧核糖核苷酸(4×dNTP) 一个循环包括：变性、退火、延伸 一般20-30个循环。 第六章 水产动物病原的检测技术（思考题） 1、名词解释：带现象、PCR 2、抗原抗体反应的一般规律有哪些？ 3、酶联免疫吸附试验中常用哪几种酶和底物？ Ag Ag Ag Ab Ab Ab C C C SRBC SRBC SRBC H H H _ _ 溶血（反应阴性） 溶血（反应阴性） 不溶血（反应阳性） 待检系统 指示系统 第一节 免疫学检测 六、酶联免疫吸附试验（ELISA） Ag-Ab+酶→底物显色→用酶标测定仪分析 优点：敏感性高，特异