球虫实验-闫文朝4.docVIP

实验二、粪便中球虫卵囊的计数、分离和孢子化培养技术（Counting, isolation and sporulation technology for coccidial oocysts in feces）【目的要求】 认识动物常见重要球虫卵囊的形态特征；掌握粪便中球虫卵囊的计数、分离和孢子化培养基本操作方法。这些操作是实验室开展球虫研究最常用的实验技术。【基本原理】 卵囊通常存在于宿主粪便中，从粪便中分离球虫卵囊的方法有饱和食盐溶液漂浮法、饱和蔗糖溶液漂浮法和饱和硫酸镁溶液漂浮法，其中最常用的方法为饱和食盐溶液漂浮法。其原理是悬浮溶液如饱和食盐溶液密度高于卵囊密度，而低于粪便中大多数杂质，经离心或静置沉淀后，大部分杂质沉淀在容器底部，卵囊漂浮在悬浮溶液的表面，然后收集表层漂浮物；由于卵囊比重大于水的比重，所以表层漂浮物用自来水稀释离心后，卵囊沉淀富集于离心管底部即可得到大量球虫卵囊。计算球虫感染强度即每克粪便中卵囊数量（oocysts per gram, OPG）和保存卵囊悬液中卵囊数量通常用麦克马斯特法(McMaster’s method)和血细胞计数板计数法，应用最广泛的是麦克马斯特法。麦克马斯特计数法的原理是用饱和食盐溶液作为悬浮溶液，把卵囊与比重较大杂质分开，使卵囊漂浮至计数室表层，与计数室上层刻度部分处在同一层面上（或同一视野内）；计数板上每个计数室容积为1×1×0.15=0.15mL（如图1示），镜检计数0.15 mL计数室内卵囊数量，最后根据粪便克数和悬液稀释倍数计算OPG值或单位体积内卵囊浓度。图1 麦克马斯特计数板结构示意图在适宜的温度通常25-28℃，湿度和充足的氧气条件下，球虫卵囊在体外进行减数分裂，一个卵囊内形成4个孢子囊，每个孢子囊内通过有丝分裂产生2个子孢子。由于粪便中大量的杂质影响氧气扩散，杂菌生长消耗氧气，使卵囊发育不良，因此孢子化培养最好在分离后进行。最好的培养液是2.5%重铬酸钾溶液，最适宜的培养温度是28℃，培养过程中需要搅拌振荡或吹气以达到增氧目的。不同种类球虫卵囊孢子化时间有差异，通常在48用次氯酸钠处理孢子化卵囊除去污染的细菌和真菌，延长卵囊保存时间。【器材准备】试剂材料：新鲜鸡粪便，饱和食盐溶液，2.5%重铬酸钾溶液。饱和食盐溶液的配制：称取400g食盐，放入三角烧瓶中，加入1000 mL沸水，搅拌充分溶解后，静置冷却，有少量盐析出，即为饱和盐水，比重约为1.18。2.5%重铬酸钾溶液的配制：2.5g重铬酸钾固体加入100 mL蒸馏水，搅拌完全溶解即可。2、仪器用具：低速离心机，托盘天平，显微镜，麦克马斯特计数板，恒温培养箱，空气浴恒温摇床，增氧泵，手动计数器，200mL锥形瓶，平皿，载玻片，盖玻片，胶头滴管。【实验步骤】1、球虫卵囊的形态学观察认识和了解球虫卵囊包括未孢子化和孢子化卵囊的一般形态结构特征，是进行动物球虫卵囊的计数、收集分离和孢子化培养的前提。球虫未孢子化卵囊：不同种属未孢子化卵囊共同特征是卵囊内呈现一团原生质，包含核质、各种细胞器等结构。其他结构如卵囊形状、大小以及卵囊壁结构与孢子化后相同（如图2所示）。图2 球虫未孢子化卵囊结构示意图艾美耳属孢子化卵囊：图2 球虫未孢子化卵囊结构示意图等孢属孢子化卵囊：均有2个孢子囊，每个孢子囊内包含4个子孢子。其他结构特征随虫种而存在差异（如图4所示）。温扬属孢子化卵囊：均有4个孢子囊，每个孢子囊内包含4个子孢子。其他结构特征随虫种而存在差异（如图5所示）。泰泽属孢子化卵囊：卵囊内存在8个子孢子和卵囊残体，无孢子囊结构（如图6所示）。图图3 艾美耳属球虫孢子化卵囊结构示意图1，极帽；2，卵膜孔；3，极粒；4，孢子囊；5，孢子囊残体；6，卵囊残体；7，子孢子图图4 等孢属球虫孢子化卵囊结构示意图1，孢子囊；2，子孢子；3：孢子囊残体图图5 菲莱氏温扬球虫卵囊1.孢子囊；2.子孢子；3.残体图图6　毁灭泰泽球虫卵囊1，子孢子；2，残体2、球虫卵囊的计数2.1粪便中球虫卵囊的计数—麦克马斯特法取2g新鲜鸡粪便置于干净的100mL烧杯内，先加入8mL饱和食盐溶液，用玻棒捣碎混匀，再加入50 mL饱和食盐溶液，混匀后立即用纱布或60目筛网过滤，然后立即吸取滤液充满2个计数室，在显微镜载物台上静置3～5min，在10倍物镜下镜检计数，每个计数室内有100个方格，其体积为1cm×1cm×0.15cm=0.15mL, 分别查完2个计数室100个方格内的卵囊数量n1和n2，最后按照如下公式计算每克粪便中卵囊数量(OPG值)：OPG= [(n1+n2)/(2×0.15)]×60÷2其中(n1+n2)/2为平均每个计数室内卵囊数，0.15为每个计数室有效体积为0.15 mL，60为粪液总体积为60 mL，2为所用粪便克数为2g。2.2 保存卵