生化和分子生物学实验指导-.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT PAGE \* MERGEFORMAT 16实验一 氨基酸纸层析法实验目的 通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。实验原理 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法又称纸色谱法，是用滤纸为支持物，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示： Rf=原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层