制备外植体与接种.pptVIP

植物的组织培养 第二节 胡萝卜的组织培养 预备任务 1人/1个无菌操作台。 每组取如下工具放于203室无菌操作台上先行灭菌 培养皿、镊子、无菌水和培养基； 带1个500 mL的烧杯，作废液缸；1个250 mL的烧杯装工业酒精150mL；带1个100 mL的烧杯。 注意 放置物品时，先关灭紫外灯，放好后，关上门，再开启紫外灯； 一、组织培养基本原理? 全能性 植物体的每一个完整的细胞都拥有形成完整植株的全部遗传信息，在一定的条件下都具有产生一株完整个体的潜在能力。 去分化 去除外植体原有的分化性状，重新进入新的发育分化状态。 组织培养的特点：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。 组织培养应用：在理论上是研究细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科的重要手段；在生产上在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛的应用。 二、组织培养的方法和步骤? 选择原则： 根据培养目的、易于诱导、带菌少。 生理状态：幼嫩的组织 取材季节：易成活，生长旺盛季节，内源激素含量高，易分化 植物的长势：生长健壮的组织 外植体大小：应根据培养目的而定 胚胎培养或脱除病毒，则外植体宜小； 快速繁殖，外植体宜大。 一般外植体大小在0.5～1.0?cm为宜。 1、培养材料的采集 2、外植体的表面消毒处理 外植体的表面清洗：洗衣粉清洗，吐温。 外植体表面灭菌（一般采用2次灭菌法） 先用70%酒精浸10～30s； 转到其它消毒溶液，灭菌液要充分浸没材料。 无菌水涮洗 涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。 灭菌剂 使用浓度 （%） 去除难易 灭菌时间 灭菌效果 酒精 70-75 易 0.1-3 好 氯化汞 0.1-0.2 较难 2-10 最好 漂白粉 饱和溶液 易 5-30 很好 次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好 次氯酸钠 2（活性氯） 易 5-30 很好 过氧化氢 10-12 最易 5-15 好 抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好 3、制备外植体与接种 将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊子等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手接触材料。 在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种2~4个，防止交叉污染。 接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。? 三、无菌操作步骤 接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开紫外线灯进行杀菌； 接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； 接种员洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，换穿拖鞋等； 上工作台后，用酒精棉球搽拭双手（特别是指甲处）和工作台面； 用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； 接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。 四、本实验—胡萝卜的接种培养 把胡萝卜切成约40mm的段； 去除表皮，去除木质部和髓； 切成约40×20×10 mm的条状，共切4块。 1、胡萝卜的切块处理 皮层 韧皮部 形成层 木质部 胡萝卜： 把切好的材料，放在100 mL的烧杯里，加入75％酒精（现配100mL ），浸泡30秒； 然后将外植体转入2％次氯酸钠中（100mL烧杯装约70mL次氯酸钠），浸泡25－30分钟； 取出材料，放入培养皿，用无菌水洗4－5分钟，重复3次。 水稻种子 取成熟种子，剥去外壳用 70％乙醇浸30秒，转至2％次氯酸钠溶液浸泡30分钟后，用无菌水冲洗4～5次，置无菌滤纸上吸干多余水分。 2、消毒和清洗（203无菌室） 把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的培养皿里，去除表面一层，然后切成约8×8×10 mm的块； 把切好的材料，用烧过的镊子夹到锥形瓶里，3-4块/瓶，包好封口膜和牛皮纸； 将培养基放到202，在23~28℃恒温避光条件下培养。 3、接种与培养 五、注意事项 防火 实验中要常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全；手上涂酒精，要干后才能接近火源。 无菌操作 材料经次氯酸钠消毒后，还需严格进行无菌操作；为防止染菌，手要用酒精擦干净，镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。 废液处理 实验完后，75%酒精和工业