deae纤维素离子交换层析法分离血清蛋白.pptxVIP

[实验目的]掌握DEAE-纤维素离子交换层析法分离血清蛋白质的实验原理及过程。 （参见教材P94-95实验十六）熟悉层析技术的相关原理。（参见教材P12-23：包括层析技术的概念、分类及分离原理。离子交换层析法的基本原理、介质种类、洗脱方式等。整套层析设备的组成及使用等）[实验原理]层析的基本原理及分类离子交换层析法本实验的分离原理如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等 层 析 是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分在两个相中的分布不同，而使各组分可以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的．固定相流动相 固定相：固定相是层析的一个基质。固体物质：如吸附剂，凝胶，离子交换剂等液体物质：如固定在硅胶或纤维素上的溶液 这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：推动固定相上待分离的物质朝着一个 方向移动的液体、气体等。 柱层析 ---- 洗脱剂 薄层层析 ---- 展层剂mobile phase Stationary phaseA representation of the principles of chromatography introduction层析分类气相(气-液;气-固)层析液相(液-液;液-固)层析根据两相所处状态吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析根据层析分离机制柱层析薄层层析纸层析根据操作形式不同返回离子交换层析法 是分析性和制备性的分离、纯化混合物的液- 固相层析方法。 它基于所研究或所分离物质的阳或阴离子和 相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据 物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸 附和脱吸附而将溶液的各组分分开。 固定相就是离子交换剂，流动相是具有一定 pH值和离子强度的电解质溶液。离子交换剂：是一类含有可解离基团的不溶性的高 分子化合物。根据交换剂的结构不同，分为 离子交换树脂 分类 离子交换纤维素 离子交换葡聚糖和离子交换琼脂凝胶根据交换剂的性能不同，分为 阳离子交换剂 阴离子交换剂 *本实验分离原理 本实验是用离子交换层析的分离原理，将血清蛋白质（白蛋白PI=4.88(4.7-4.9); α1球蛋白PI=α1球蛋白PI = 5.06; β球蛋白PI=5.12; γ球蛋白PI=6.85-7.50 ）在pH为8的条件下交换到装在柱子中的DEAE纤维素离子交换剂（阴离子交换剂）上后，应用梯度洗脱法，逐渐改变pH与离子强度，将血清中各种蛋白质组成成分逐步洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。各血浆蛋白质的等电点组成比例pI分类pH8.0清蛋白?1-球蛋白?2-球蛋白?-球蛋白?-球蛋白56一62％4一7％9一11％11一15％12一16% — 4.64 5.06 5.06 5.126.85-7.3 — — — —[实验操作]纤维素的处理仪器连接与装柱上样与洗脱实验操作一、纤维素的处理 DEAE-纤维素 6g0.5M HCl 50 ml膨润混匀后静置30分钟充分洗涤至 PH≥40.5M NaOH 50 ml转型混匀后静置30分钟充分洗涤至 PH≤8平衡0.01 M Na2HPO4 100 ml反复平衡至 PH = 8膨润的作用1、使层析介质形成其特定功能基团2、加大纤维素之间的距离，以利于蛋白质的通过3、清除杂质转型或再生的作用1、用置换能力强、浓度高的离子将层析介质所结合的离子置换下来2、清除杂质平衡的作用1、用交换能力弱的离子取代交换能力强的离子，有利于蛋白质的置换并防止蛋白质的变性2、设定起始的离子强度和PH值实验操作二、仪器的连接与装柱装柱前注意事项一定要检查柱子两端是否流通，确保柱子不堵。然后组装好层析柱，并连接好恒流泵、紫外检测仪、及记录仪。在紫外检测仪的出口端放一只烧杯接流出液。 装 柱层析柱下口旋紧、层析柱上口打开封闭良好、防漏从上口倒入液体起始洗脱液，排气、查漏上口倒入纤维素已平衡好的纤维素纤维素1/2~2/3高度保留弯月形液体界面纤维素沉降完全流出管口封闭装柱注意事项将处理好的纤维素悬液倾入层析柱内 （注意不要带入气泡，如混悬液过浓，可增加适量Na2HPO4液）打开恒流泵，使液体流出，控制流速为3-6秒1滴。直到全部纤维素都放入柱内（或柱中纤维素沉积至一定高度）注意：一定不要干柱装柱后期再次检查整套层析设备是否正确连接调好检测零点及流速：以0.01mol/L Na2HPO4为标准调基线（吸光度A为5%， 透光率T为95%）；流速为5-10滴每分钟(6-12秒1滴)。记录仪：摘下笔帽，笔落下，启动，测量状态，走纸速度为6cm/h, 量程为100mV实验操作三、加样当液面接近纤维素顶上界面（注意：一定不要干柱），关闭恒流泵。用吸量管小心在层析管内接近纤维素层处缓慢加入血清0.5mL（注意不要搅拌纤维素界面）。打开恒流泵