试验三质粒DNA的抽提与纯化.DOCVIP

实验三：质粒DNA的抽提与纯化 目的： 采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术， 原理： 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 仪器与主要试剂： 仪器（见附录）： 主要试剂： 溶液I： 50 mmol/L　葡萄糖 10 mmol/L　EDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2毫克/毫升　溶菌酶 溶液II： 200 mmol/L NaOH 1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTA 实验方法： 将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时 转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒 小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀 加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟 加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟 加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟 12000rpm离心15分钟 将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提一次 加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc(3 mol/L,pH5.2)，盖紧，并翻转EP管数次混匀 置于-20℃冰箱1～2小时 15000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀 70%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干 将沉淀溶于50μl TE缓冲液或去离子水，完全溶解后，-20℃保存 取样5μl，在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA条带。 附注： 溶液Ⅰ--－溶菌液 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。 EDTA的作用： 螯合Mg2＋ Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。 EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 溶液Ⅱ--NaOH-SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时，该系统的PH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性. SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3…R┿-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。 溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc(pH4.8)溶液 NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸.所以该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液.用PH4.8的NaAc溶液是为了反pH12.6的抽提液,调回PH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在.而高盐的3MOL/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之.前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全. 4. 为什么用无水乙醇沉淀DNA? 用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂. DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右.因而也可改用95