植物体内销酸还原酶活力的测定.pptVIP

实验二 植物体内硝酸还原酶活力的测定 NO3-和NH4+是能被植物利用的最主要的氮源。在一般田间条件下， NO3- 是植物吸收的主要形式。 硝酸盐的还原 硝酸还原酶是一种诱导酶，在植物体内本来不含有，但在特定外来物质的如NO3-诱导下可以生成硝酸还原酶。 【实验原理】 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐： NO3- +NADH + H+ NO2- +NAD+ +H2O 产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以单位时间内每克鲜重含氮量表示，即以μg/g/h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 【实验器材】 ⑴冷冻离心机；⑵分光光度计；⑶天平 (0.01g)；⑷冰箱；⑸恒温水浴；⑹研钵；⑺剪刀；⑻离心管；⑼移液管(5、2、1mL) ；⑽洗耳球；⑾试管架；(12)胶头滴管。 【实验步骤】 标准曲线制作 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0-0.20μg/mL的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮浓度（μg/mL）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（r）建立回归方程。 酶的提取 称取0.5-1g 鲜样（诱导组和非诱导组分别进行），剪碎置冰箱冰冻30min，取出置研钵中，冰浴研磨成匀浆，转移入离心管中，洗研钵2-3次，将液体转入离心管中，共用提取液6 mL，4℃ 8000rpm离心15min，上清液即为粗酶提取液。 酶反应 取4个10 mL离心管，按照下表所列进行操作，混匀，25℃保温30min。 【结果计算】 样品中酶活性（μg ·g-1·h-1）= X ——反应液酶催化产生的亚硝态氮浓度（μg/mL）； V1——提取酶时加入的提取缓冲液体积（mL）； V2——酶反应时加入的粗酶液体积（mL）； V3——与磺胺等发生颜色反应的总体积（mL）； W ——样品质量（g）； t ——反应时间（h）。 【注意事项】 硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4℃下进行。 制作标准曲线时，从显色到比色时间尽可能保持一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。 【思考与作业】 比色测定前加入磺胺和萘基乙烯胺的顺序不能颠倒的原因是什么？ * * 植物生物学实验-植物生理部分 硝酸盐 硝酸还原酶 亚硝酸盐 氨 亚硝酸还原酶 NR 小麦的新鲜叶片（诱导组和非诱导组） 【实验材料】 0.20 0.16 0.12 0.08 0.04 0.02 0 每管亚硝态氮浓度μg/mL 2 2 2 2 2 2 2 0.2%萘基乙烯胺 2 2 2 2 2 2 2 1% 磺胺 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0.9 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 0 亚硝酸钠标准液 试剂 取量mL 7 6 5 4 3 2 1 管号 终止反应和比色测定 30min后立即加入l mL磺胺溶液终止酶反应，再加l mL萘基乙烯胺溶液，显色30min后于4000rpm离心5min，取上清液在540nm下比色测定。根据标准曲线计算出反应液中亚硝态氮浓度（μg/mL ）。 反应底物 酶反应管 粗酶液 /mL 0.1mol / L KNO 3 磷 酸缓冲液 /mL NADH 溶 液 /mL 0.1mol / L pH7.5 磷酸缓冲液 /mL 非 诱导 － 对照 1 .0 1. 6 0 0.2 非 诱导 － 实验 1.0 1. 6 0.2 0 诱导 － 对照 1.0 1. 6 0 0.2 诱导 － 实验 1. 0 1. 6 0.2 0 X * V3 / V2 * V1 W * t