酵母的培养与数量测定.PPTVIP

金陵中学 许 峰 一、酵母菌的培养 培养基：质量分数为5%的葡萄糖溶液 无菌马铃薯培养液或肉汤培养液 无菌麦芽汁 无菌马铃薯培养液 材料：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，1000 mL水。 （1）配制：将去皮马铃薯，切成约2cm2的小块，放入盛有1000 mL水的水浴锅（能盛1000 mL水的锅即可，若用烧杯，应注意杯底受热是否均匀）煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底。30min后，用双层纱布过滤，过滤时用玻棒引流，取其滤液加糖，再补足水至1000 mL。 接种 菌种来源：保藏的菌种（固体或悬液） 干酵母+葡萄糖溶液活化 注意无菌操作！ 培养 恒温箱或恒温水浴锅（28℃），不定期搅动培养液 取样前需摇匀 向计数室添加样品向计数室加样品时，先将计数室盖上盖玻片，用无菌细滴管沿盖玻片边缘滴入少量菌液，菌液自行沿边缘缝隙渗入计数室。计数室要充满菌液，不能存有气泡。 稀 释 小方格内酵母菌数量过多，难以计数，就要对菌液进行适当稀释后再计数。一般样品稀释后适宜范围是少于 10 个菌体/每小格。根据需稀释的倍数，精确算出应加入的无菌水量， 如lmL 菌液欲稀释100 倍，则需向lmL 菌液中加入99mL 无菌水，而不是加入100mL 无菌水。 染 色 美蓝是无毒性染料，碱性条件下，用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 血球计数板的清洗 血球计数板使用结束后，应用清水浸泡、冲洗，不能用刷子等硬物洗刷，自然晾干或吹风机吹干后，镜检每个小格中是否存有污物、残菌，如不清洁，需重新清洗直至洁净。 无菌操作 要防止杂菌污染给实验结果带来影响。每次抽样检测用到的蒸馏水、玻璃器皿、滴管等要事先经无菌化处理，血球计数板、载玻片、盖玻片等必需保持洁净。 每次取样观察要规范，实验用过的器材要清洗干净，需灭菌的器具则一定要灭菌。 * 酵母菌的培养与数量的测定 培养基的营养要素应包括：碳源、氮源、水、无机物等 （2）分装、包扎：将培养液趁热分装到洁净的试管中，注意不要将培养液沾在试管口和试管上段，以免引起污染。待分装完毕，每支试管加塞后把试管扎成捆后，包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。然后用记号笔注明培养基的名称、组别、日期。取样、计数时所用的1mL刻度吸管和滴管也分别包纸，以备灭菌。 （3）灭菌：使用高压蒸汽灭菌锅灭菌。 121℃,100kPa 20min 接种与培养酵母菌 二、酵母菌数量的测定 显微镜直接计数法：使用血球计数板等计菌器进行酵母菌的计数。 优点：直观、快速、操作简单。 缺点：所测得的结果是死菌体与活菌体的总和。 取样与滴加培养液 计 数 对于压在小方格界线上的酵母菌应取相邻两边及顶角计数。 如果将染液直接滴在血球计数板上，菌液浓度改变，无法对实验结果精确计算。 正确的做法应是另外制作装片，通过染色对活菌和死菌加以区分，算出两者比例，进一步换算出总菌体数中的活菌数。 *