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实验一、聚合酶链式反应－PCR 一、实验原理： PCR又称聚合酶链式反应，是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由 高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温下， 待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温情况下，两 条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在 Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原 料，Mg2+存在下，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链 的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链 DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模 板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍， PCR产物得以指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因 扩增数百万倍。 １．DNA模板：反应中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA纯度较 高， 以增加反应特异性。 ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低 Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基 左右；G+C含量在40％－70％之间；引物内部不能有回该 序列；引物３’端不能互补。 ５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在95℃时30分钟还有50％活力。 说明 PCR过程示意图 二、实验所需器材和试剂 器材： 台式高速离心机，恒温水浴锅，PCR扩增仪，琼脂糖 凝胶电泳系统，凝胶成像系统，Eppendorf离心管， PCR小管 试剂： 　 引物1，引物2，dNTP mix，10X PCR Buffer， Taq DNA 聚合酶，EB，上样缓冲液，　marker，琼 脂糖，TBE缓冲液 三、实验步骤 1：加样 按次序在PCR小管中加入下列试剂（50ul体系）： 　　 5ul 10X PCR Buffer 4ul dNTP mix 2ul 引物1 2ul 引物2 3ul 模板 1ul Taq DNA polymerase 加水到总体积50ul 注意事项：同时设立对照组（对照组不加模板DNA） 2、按以下参数进行PCR扩增（对于不同的PCR反应应设置不同的反应条件） 94℃ 4分钟 94℃ 30秒 51℃ 30秒 进行30个循环 72℃ 30秒 72℃ 5分钟 4℃ 　 将实验组与对照组放入PCR仪，按设定好的条件进行扩增 3、扩增结束后，取5ul产物进行琼脂糖凝胶电泳以观察结果 PCR结果示意图 四、作业 1，图示实验结果 2，掌握PCR原理、学会分析实验结果