限制性内切酶1，限制性核酸内切酶.pptVIP

能完全肯定的识别位点和切割位点，但切割位点也是的一侧的一定距离，通常距特异性位点24bp-26bp。 在基因工程操作中用途不大。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG III类限制性内切酶 * * 核酸内切酶分为单链DNA内切酶和双链DNA内切酶。能定点切割DNA双链的内切酶称为限制性内切酶。 限制：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 修饰：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 限制酶概念提出的背景： 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染 E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。 1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一 种是核内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁 殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。 * * I型限制性内切酶作用时需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）存在。 * 粘性末端的意义： ①连接便利 不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。 同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 ② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某链的核酸内切酶。 主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。 类似于DNA测序中的化学修饰法 第1个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写 第4个字母代表株 最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号 命名 限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 根据限制性内切酶的识别位点和切割位点以及所需要的辅分为3种不同类型。 I 型：切割位点不确定，不适用于基因工程。 Ⅱ型：基因工识别位点，对分子克隆操作 亦无实用意义。 首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株分离得到。 I型限制性内切酶 作用原理：识别双链DNA未甲基化修饰的特异序列，别位点约1000-1500bp处随机切开一条单链，造成大约75个核苷酸的切口。 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜菌株中分离出来。 作用原理：识别双链DNA上未甲基化修饰的一 小段明确的序列（文序列），然后在识别位点之内的特定位置切割。 II型限制性内切酶 一般性状 对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用， 识别序列 通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。 酶切切口 齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具（不易重新连接）