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比色法测定胆固醇氧化酶酶活季文明　陈毅力　张和春　王武摘　要：?根据实验结果和理论计算确定检测体系中胆固醇的质量浓度为0.387 mg/mL，表面活性剂的质量浓度为0.2 g／dL，确定过氧化氢浓度与反应液吸光度之间的定量关系.在此基础上，建立了比色法测定胆固醇氧化酶酶活的方法.关键词：?胆固醇氧化酶；胆固醇；比色法检测中图分类号：?Q554　　　文献标识码：?A文章编号：1009-038X(2000)03-0251-03Colorimetric Determination of the Activity of Cholesterol OxidaseJI Wen-ming, CHEN Yi-li, ZHANG He-chun, WANG Wu(School of Biotechnology, Wuxi University of Light Industry,Wuxi 214036)Abstract：?In the paper,Determined the choleterol and the detergent in the final solution were determined as 0.387 mg/mL and 0.2 g/dL respectively. A linear equation about the quantitative relationship between the hydrogen peroxide and the absorbency was set up.The colorimetric determination method of the activity of cholesterol oxidase was established.Key words:?cholesterol oxidase; cholesterol; colorimetric determination　　胆固醇氧化酶是一种多功能酶［1］.目前，检测血清胆固醇含量的诊断试剂就应用了胆固醇氧化酶.胆固醇氧化酶可以降低食品中的胆固醇含量［2］；能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖，是一种生物杀虫剂［3］；胆固醇的氧化产物——胆甾-4-烯-3-酮还具有抗肥胖、治疗肝病等药效［4，5］.　　测定胆固醇氧化酶活性的方法有胆甾酮分析法、过氧化氢分析法、液相色谱法和薄层层析法等多种方法［6］.酶催化反应过程中，氧化 1 mol 胆固醇，产生 1 mol 过氧化氢.比色法是依据过氧化氢在过氧化物酶的作用下分解，可使4-氨基-安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物，在500 nm处有最大吸收峰的原理［7］，通过测量反应液在500 nm处的吸光度，就可以定量测定胆固醇被氧化的量，从而计算出胆固醇氧化酶的酶活单位.1　材料与方法1.1　材料1.1.1　菌种　产胆固醇氧化酶短杆菌DGCD-2　实验室保藏.1.1.2　试剂　胆固醇　BR　上海生化试剂公司提供；4-氨基-安替比林　AR　华东师范大学化工厂产品；辣根过氧化物酶　华美公司提供；过氧化氢 AR　宜兴第二化学试剂厂产品；其它试剂均为分析纯.1.1.3　培养基种子培养基　(g/dL)：牛肉膏0.3，蛋白胨1，NaCl 0.5, pH 7.5；发酵培养基(g／dL)：胆固醇0.05，葡萄糖2，酵母膏0.75，NaCl 0.01，pH 7.5.1.1.4　试剂　溶液A　4-氨基-安替比林　1 mmol／L；苯酚　6 mmol／L；磷酸钾缓冲液　pH＝7.5　25 mmol／L；叠氮钠　0.02%；辣根过氧化物酶　7 000 U／L；Triton X-100　0.2%；溶液B　试剂A(不含有Triton X-100)；溶液C　过氧化氢 2.584 mmol／L；溶液D　胆固醇／异丙醇溶液(含Triton X-100, 4.26%)　0.826%；溶液E　胆固醇／异丙醇溶液　0.826%.1.2　仪器　　721分光光度计　上海第三分析仪器厂生产.1.3　方法1.3.1　培养方法　斜面→种子培养液→发酵液；装液量均为250 mL的三角瓶装30 mL培养液，30 ℃，220 r／min，种子培养12 h，接种量为10%，发酵培养36 h.1.3.2　胆固醇溶解度试验　在溶液E中加入不同量的Triton X-100，取150 μL，加入3 mL溶液B中，在光照下观测丁达耳现象，500 nm处测吸光度.1.3.3　标准曲线反应时间的确定　取溶液B 3 mL于试管中，37 ℃保温3 min；加入溶液C 75 μL，反应不同时间，检测500 nm处的吸光度.1.3.4　确定标准曲线的反应　取溶液B 3 mL于试管中，37 ℃保温3 min；加入不同量溶液C，反应5 min，在