微生物专题试验指导试验五微生物培养基的配制和灭菌目的要求.DOCVIP

实验五 微生物培养基的配制和灭菌 一、目的要求 1、了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 2、了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 3、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。 二、实验原理 （一）培养基 1、根据所培养微生物的种类作分类 根据微生物的种类可分为：细菌、放线菌、酵母菌和霉菌培养基。 常用的异养型细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，常用的自养型细菌培养基是无机的合成培养基，常用的放线菌培养基为高氏一号合成培养基，常用的酵母菌培养基为麦芽汁培养基，常用的霉菌培养基为察氏合成培养基。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下 96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其 pH 凋至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 （1） 天然培养基 常见的天然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃薯等。实验室中常用牛肉膏、蛋白胨及酵母膏等。 （2） 合成培养基 （3） 半合成培养基 3、根据培养基的物理状态作分类 （1）液体培养基 （2）固体培养基 （3） 半固体培养基 （4） 脱水培养基 4、根据培养基的功能作分类 （1） 选择性培养基 （2） 鉴别培养基 （3） 种子培养基 （4） 发酵培养基 （二）无菌技术 ??灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。  加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内?蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。 1.高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是 基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。 2.干热灭菌法  通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。  干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。 3.干燥箱灭菌  将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。  用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。 4.火焰灭菌  直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见图1）。此外，接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来达到灭菌的目的。 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。 7、化学药剂消毒灭菌 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。 三、实验器材 1.药品及试剂： 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O等。 2.仪器及其它 高压蒸汽灭菌器、恒