免疫诊断试剂原理（酶联免疫分析法）ppt课件.pptVIP

一、化学发光分析 1、化学发光（chemiluminescence，CL） 一些物质在进行化学反应时，吸收了化学反应过程中产生的化学能，使得分子外层电子激发到激发态，生成激发态产物。当电子从激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级时，以光辐射的形式释放能量，这个发光过程称为化学发光，其反应过程如下： 发光效率表示一个化学发光分子的量子产率，指每摩尔反应物辐射出光子的量。 第三节 发光酶联免疫分析 2、化学发光分析 化学发光分析是根据化学反应产生的光辐射确定物质含量的一种痕量分析方法。 化学发光免疫分析（CLIA）是将化学发光反应与免疫反应相结合而对抗体、抗原或半抗原进行测定的一种免疫分析方法。 第三节 发光酶联免疫分析 3、化学发光剂 用作标记的化学发光剂应符合以下条件： ①能参与化学发光反应； ②与抗原或抗体偶联后能形成稳定结合物； ③偶联后仍保留高的量子产率和反应动力； ④不改变或极少改变被标记物的物理化学特性，特别是免疫活性。 常用的化学发光剂有吖啶酯类化合物、氨基苯二酰肼类化合物、咪唑类化合物、苯酚类化合物、芳基草酸酯类化合物等。 第三节 发光酶联免疫分析 （1）吖啶酯类化合物 吖啶酯是三环有机化合物，很容易氧化。 当其在碱性介质中氧化时，经历共价键的断裂，产生二氧酮的中间体，然后形成电激发的N-甲基吖啶酮。当它回复到基态时在430nm处释放出光子。 在加入H2O2及随后加入NaOH调节至所需pH之前维持一低pH以实现最佳氧化过程，可加速其氧化反应。 吖啶酯氧化反应如图7-12所示。 第三节 发光酶联免疫分析 图7-12 吖啶酯氧化反应过程 第三节 发光酶联免疫分析 吖啶酯类化学发光剂的典型代表是光泽精（N,N′-二甲基吖啶硝酸酯）。 它在碱性条件下，与H2O2等过氧化物作用形成发光体激发态N-甲基吖啶酮。 能促使光泽精激发的物质还有丙酮、次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、羟胺及抗坏血酸等。 光泽精的氧化反应如图7-13所示。 第三节 发光酶联免疫分析 图7-13 光泽精的氧化反应 第三节 发光酶联免疫分析 二、ELISA酶联方法和试验方法 1、ELISA酶联方法 ELISA酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 （1）戊二醛交联法 戊二醛是一种双功能团试剂，它可以联结具有氨基的酶和蛋白质。 戊二醛交联法有一步法、两步法两种。 第二节 酶联免疫吸附分析法 图7-2 戊二醛一步法反应原理 ①一步法 将戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。 该法操作简便、有效，重复性好。 缺点是交联反应是随机的，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。 第二节 酶联免疫吸附分析法 图7-3 戊二醛二步法反应原理 ②两步法 先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体；或先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。 两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，有助于本底的改善。 第二节 酶联免疫吸附分析法 （2）过碘酸盐氧化法 本法只适用于含糖量较高的酶。 辣根过氧化物酶（HRP）的标记常用此法。 反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。 图7-4 过碘酸盐氧化法 第二节 酶联免疫吸附分析法 2、ELISA试验方法 ELISA法中有三个必要试剂：①固相抗原或抗体；②酶标记抗原或抗体；③酶反应底物。 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 如双抗体夹心法、间接法、竞争法、异种动物抗体双夹心法、抗酶抗体法、竞争性抑制法、双夹心法和抗原直接包被法等方法。 第二节 酶联免疫吸附分析法 （1）双抗体夹心法 双抗体夹心法（double antibody sandwich，DAS-ELISA）由Clark和Adams于1977年建立，是最经典的ELISA检测法。 该法的灵敏度高，特异性强，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求技术性强，成本较高。 该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。 第二节 酶联免疫吸附分析法 图7-5 双抗体夹心法 第二节 酶联免疫吸附分析法 （2）间接法 间接法（indirect ELISA）是最常用的ELISA检测方法，其原理是利用酶标记的抗体和已与固相抗原结合的受检抗体相结合。 该法只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 该方法不必为每个待测抗体（或抗原）制备特异性的酶标抗抗体（或酶标抗体），