基因诊断常用技术课件.pptVIP

基因检测常用技术;检测技术的发展;Watson and Crick made a model of the DNA molecule and proved that genes determine heredity. ;1957-Arthur Kornberg (1918- ) of the U.S. produced DNA in a test tube. ;1966-The Genetic code was discovered; scientists are now able to predict characteristics by studying DNA. This leads to genetic engineering, genetic counseling. ;1972-Paul Berg (1926- ) of the U.S. produced the first recombinant DNA molecule. ;;;基因组DNA的基本结构与化学组成;1核苷酸=1磷酸+1五碳糖+1碱基 核酸分两类 DNA:碱基A,G,C,T RNA:碱基A,G,C,U;双螺旋结构： 是由2条平行的多核苷酸围绕同一中心轴构成的。多核苷酸的方向是由核苷酸的磷酸二酯键的走向决定，一条从5’ →3’，另一条从3’ →5’，两条链呈反向平行排列，彼此由氢键相连，G与C配对，A与T配对。;En; 1 ggggacagcc agggacaggc agacatgcag ccagggctcc agggcctgga caggggctgc 61 caggccctgt gacaggagga ccccgagccc ccggcccggg gaggggccat ggtgctgcct 121 gtccaacatg tcagccgagg tgcggctgag gcggctccag cagctggtgt tggacccggg 181 cttcctgggg ctggagcccc tgctcgacct tctcctgggc gtccaccagg agctgggcgc 241 ctccgaactg gcccaggaca agtacgtggc cgacttcttg cagtgggcgg agcccatcgt ;第一代诊断技术- 限制性片段长度多态性检测（RFLP）;;镰性细胞贫血;;第一代诊断技术- Southern杂交;Southern杂交基本步骤;Deletion;第一代诊断技术- DNA体外扩增技术;PCR技术出现的背景;;PCR 反应参数 ;循环中的复性（退火）：PCR 的一个关键参数，在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。如何解决这个矛盾？合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm[4X（C+G）+2X（A+T）或软件计算] 低5℃,当产物中出现影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。退火温度越高,所得产物的特异性越高。 ;当多重PCR扩增各引物对Tm值出现差异时，如何初步确定退火温度？一是将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃；二是根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。 当退火温度较高以致接近延伸温度时，如何设定PCR参??？将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。 退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度，因此……;循环中的延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 ;循环次数 ：循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。 如经25-30 轮循环扩增后,产物量仍不够 怎么办？一是增加模板量重新扩增；二是将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应