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PCR基础知识 聚 合 酶 链 式 反 应 聚合酶链式反应（polumerase chain reaction，PCR） 是依赖于靶DNA序列侧翼上做结合的两个寡核苷酸引物 在体外由DNA聚合酶催化合成特异性DNA片段的方法。 PCR扩增反应体系 模板DNA -- 扩增起始底物 --影响扩增的特异性和产量 要求： 引 物 -- 寡核苷酸片段 --决定PCR扩增的特异性和长度 要求：特异性好（特别是3’端与模板配对） 长度适宜（一般以15bp～30bp为宜） 碱基组成分布尽可能随机 引物自身或两条引物间无互补结构 聚 合 酶 -- 耐热DNA聚合酶--活性依赖金属离子 作用：有5’-3’链延伸活性（合成方向 5’-3’ ） 有5’-3’外切酶活性 (清楚 “阻碍物” ） 无3’-5’外切酶活性（错配率2.1×10-4） d N T P -- 合成DNA的原料 PCR扩增反应过程 变性—通过加热，使双链DNA模板解离成为单链 变性温度：由模板DNA双链的G+C含量决定 变性时间：由模板DNA分子的长度来决定 退火—温度下降，引物与模板互补碱基结合成双链 温度计算：Tm = 4×（G+C）+2（A+T) 温度设置：通常比溶解温度低3-5度 延伸—适当温度，DNA聚合酶催化合成新的DNA链 最适温度：72-78℃ （ TaqDNA聚合酶 ） 合成速率：2000bp/min 未知基因突变的筛查 PCR-单链构象多态性 原理：长度相同，但碱基组成顺序不同（甚至单个碱基不同）， 的DNA单链，非变性条件下形成的空间构象不同，在非 变性凝胶中的电泳迁移率不同而表现出的DNA多态性， 方法： 注意事项： 扩增产物：片段长度400bp — 限制酶酶切后在检测 扩增的特异性好 — 调整扩增体系或条件 变性处理：避免产物浓度高 — 合理稀释（1:4或1:6） 变性完全且稳定 — 加样时在冰浴下进行 电泳条件：凝胶基质 T=8%-10%，C=1.3%-2.6% 0.4mm-0.4mm 添 加 剂 10%-15%的蔗糖或甘油 凝胶温度 不加甘油， 4℃-10℃ 添加甘油，20℃-25℃ PCR-变性梯度凝胶电泳 原理：同样长度但碱基序列不同的DNA片段其解链区域及各 解链区域的解链条件不同，因此它们在凝胶电泳分离 过程中，可在变性剂浓度不同的位置处发生部分解链 导致迁移速率大大下降，从而在凝胶中被区分开来。 方法： 主要优点： 检出率高：如果突变发生在最先接连的DNA区域 检出率可达100% 片段较长：最适检测片段长度为100-500bp 一般可以检测1000bp 注意事项： GC-Clamp：片段长度 30-40个GC组成 （可以借助计算机程序设定) 扩增产物：不宜用于G-C碱基较高（70%）基因突变筛查 （可选用SSCP方法进行筛选） 突变确定：DNA序列分析 (不能确定突变的位置和种类）