蛋白质印迹法 Western Blot技术5.pptVIP

Western blot 实验技术 ; Western blot的定义 Western blot的基本原理 Western blot的一般流程 Western blot的常见问题;定义;基本原理;一般流程;蛋白质样品的制备;（1）25mg/mL BSA的配制: 取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标 准(20mg BSA)中，充分溶解后配制25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也以-20℃长期保存。 （2）1mg/mL BSA的配制: 取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用1×loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL，按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20℃。 （3）60% TCA工作液的配制: 取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水中，即为60% TCA工作液，使用前配制。 （4）配制BSA标准系列和样品 如表格：;; 蛋白样品 5μl，1×loading buffer 45μl，ddH2O 50μl，TCA 66.7μl，放置15-30min，用酶标仪，λ=595nm处测定蛋白含量。; SDS电泳 基本原理： 在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异 。; 蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。 因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质亚基分子量的大小。 当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。 ;电泳步骤： 1.清洗玻璃板 2.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶 （2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2／3处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（30min）。;（3）当水与胶之间有一条明显的折射线时，说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒去上层水，并用吸水纸将水吸干。 （4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好拔）。 (5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃板内侧）;（6）根据测出的蛋白含量，计算出含一定质量蛋白的溶液体积即为上样量。上样前要将蛋白于沸水中煮沸10min使蛋白变性，并12000r／min离心5min。 3.电泳 在浓缩胶中电压可为80V，至溴酚蓝进入分离胶后将电压转换为90V,电泳至溴酚蓝离下边缘1cm处时停止电泳。;转 膜;2.将玻璃板撬开，去掉小玻璃板。将浓缩胶轻轻刮去，小心的剥下分离胶先放于转移缓冲液中。（在撬玻璃板时要小心，因玻板易碎。剥离分离胶时要注意不要弄破分离胶） 3.放置顺序：阴极-海绵垫-三层滤纸-分离胶-膜-三层滤纸-海绵垫-阳极。（顺序不能反了，膜盖上后不可移动，每盖一层，要用玻棒擀出其中的气泡。第二、三步时戴手套，因转移缓冲液中含甲醇，实验室要开门空气流通。） 4.把夹子放入转移槽中，黑面对对槽的黑面，白面对槽的红面，转移时会产热用冰块降温。一般150V，400mA转膜1：30h。 5.将膜晾干备用。;封闭;一抗杂交;二抗杂交;底物显色;Western blot的常见问题;5.凝胶肿胀或卷曲 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min. 6.在转膜过程中会产热，因为缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。所以应放置冰块降温。 7.背景太深： 原因： 7.1 膜没有充分浸湿 7.2膜或缓冲液污染 7.3封闭液封闭不完全 7.4 抗体浓度过高