胆固醇不仅是食品中重要的一种营养物质5.docVIP

胆固醇不仅是食品中重要的一种营养物质，还 与食品感观品质的变坏和有毒物质的出现密切相 关，因为以胆固醇为底物氧化产生突变物，致癌物和 细胞毒素的作用已经被证明[1~3]。此外，它还与家畜 的生长[4]、繁殖[5]等经济性状相关，而研究胆固醇与 它们的关系，首要的前提条件就是能够准确地测定 出胆固醇的含量。 经典的测定胆固醇的方法是Liebermann- Burchard 显色反应或Zlatkis 法[6]，另一个常用的方法是 利用酶法来通过胆固醇的氧化来测定。但这些方法 都是不严格的, 会受到干扰物质对胆固醇准确测定 的影响。为了克服这个问题，气相色谱技术目前更 适用于胆固醇的分析[7]。胆固醇是肉中非皂化脂部 分的组分。利用色谱分析有2 种可以选择的预处理 方法：第1 种是先提取总脂后皂化，然后再提取非皂 化物；第2 种是直接皂化样品然后再提取非皂化的 组分。目前我国国标规定测肉类中的胆固醇是用第 1 种方法，但在实际的操作中, 该方法存在操作繁 琐、有机溶剂消耗大，样品的测定结果回收率低和重 复性差的缺点。相比之下第2 种方法则具有简便、准 确，用于测定的样品量需求少的优点。 但在实验研究中发现，测定不同组织中胆固醇 的含量用一成不变的预处理方法是不可行的，因为 其回收率和重复性会存在很大的差异，所以针对不 同的组织测定方法应有所变化。此外，目前文献报 道的预处理方法常是将提取液蒸干后再溶解上机， 其操作复杂，影响样品的回收率和重复性，所以本研 究的目的是选取人们最喜食的猪背最长肌、脂含量 高难于皂化的脂肪组织和胆固醇含量最高的肝脏组 织为代表, 发展一套能准确测定不同组织胆固醇含 量同时又兼顾降低成本、简便易行的方法。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 样本实验用槐猪组织样（肝脏、脂肪、肌 肉）采自福建省上杭县绿琪槐猪育种场，取样后立即 放入液氮中保存，直到胆固醇测定。 1.1.2 试剂5-α 胆甾烷、丁化羟基苯甲醚（BHA） 购于Sigma。胆固醇、氢氧化钾、氯化钠、异辛烷、正 己烷、石油醚、乙醇都购于北京化学试剂公司为化学 纯。 1.1.3 试液配置内标溶液：无水乙醇配置的终浓 度为200 mg/L 的5-α 胆甾烷溶液。 加标液：无水乙醇配置的终浓度分别为100、 150、200 mg/L 的胆固醇溶液。 萃取液：分别配制含0.01%(W/V)BHA 的异辛 烷、正己烷和石油醚溶液。 皂化液：无水乙醇（含0.125% 的BHA）与蒸馏 水（55∶44）以此比例混合均匀，用混合液做溶剂再分 别配11.5%、17.25%和23%（W/V）的氢氧化钾溶液。 1.1.4 主要仪器和设备恒温水浴锅；氮气吹干 仪；涡旋振荡器；移液枪；HP 6890 气相色谱仪。 1.2 方法 1.2.1 色谱条件HP 6890 气相色谱仪（Agilent Technologies,Inc.）,FID 检测器，进样口温度300℃， 4ilent 19091J- 413 HP- 5 柱，30.0 μm×320 μm×0.25 μm， 柱温250℃，载气流速5 mL/min，进样量1.0 μL,分流进 样，分流比20∶1。 1.2.2 标准溶液的配制配制1 mg/mL 的胆固醇原 液和1 mg/mL 的5- α 胆甾烷原液，分别取0.25、0.5、 1、1.5、2、2.5 mL 的胆固醇原液和2 mL 的5- α 胆甾 烷原液于10 mL 的容量瓶中定容，使胆固醇的最终 浓度分别为25、50、100、150、200 mg/L 和250 mg/L, 5- α 胆甾烷的终浓度为200 mg/L。 1.2.3 直接皂化及提取称取肝脏、脂肪、肌肉组 织分别0.15、0.3 g 和1 g 装入带有聚四氟乙烯内垫 的螺纹帽耐热玻璃试管中。加入1 mL 的内标溶液和 7.3 mL 的皂化液。然后将试管内充溢氮气，使液体 上方的空气排除。将试管置于80℃的水浴中皂化， 每隔5 min 拿起剧烈振荡30 s 后放回，直到残留物 完全消失，溶液澄清。随后立即置于冰上冷却后，加 入适量的萃取液，涡旋振荡2 min，静置，直到观察到 分离相，用移液枪将上层有机相吸出，如此重复3 次，并将3 次吸取的有机相合并到一个干净的试管 中，置于氮气吹干机下，干燥浓缩到适当的体积，移 入上机小瓶用于气相色谱仪分析。 1.2.4 定量方法（内标法） 标准曲线的制作依次 取上述不同浓度的标准溶液，上机。以胆固醇/ 胆甾 烷量比为横坐标x，胆固醇/ 胆甾烷峰面积比为纵坐 标y，绘制标准曲线。 1.2.5 计算样品中胆固醇的含量根据标准曲线 拟和的线性回归方程计算样品中胆固醇的含量 （mg/100 g）。 2 结果与讨论 2.1 样品皂化液与皂化时间的选择对于脂肪含 量较少的肌肉组织