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 第 十 章 转基因动物与生物反应器 ;10.1转基因技术 ;10.1.1 细胞转染外源基因的方法 ;10.1.1 细胞转染外源基因的方法 ;10.1.1 细胞转染外源基因的方法 ;二、化学方法生 1、DEAE-葡聚糖法 将外源DNA片段与DEAE——葡聚糖等高分子碳水化合物混合，这样DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE的正电荷基团上。 2.磷酸钙-DNA共沉淀法：磷酸缓冲液（pH7.1）溶解DNA，加氯化钙，磷酸钙与DNA共沉淀形成大颗粒。通过钙、磷诱导细胞吞噬或脂相收缩的空隙，DNA进入细胞。 3.脂质体载体包埋法：人工膜泡（载体）包裹DNA，与受体细胞融合。; 10.1.2 转染细胞的鉴定 ;10.2 转基因动物;10.2.1 发展历史 ;10.2.2 转基因动物的制备 ;10.2.2 转基因动物的制备 ;3种转基因的方法及其与发育阶段的关系：; 转基因动物鉴定技术： 早期采用的、也是目前最有权威性的转基因动物鉴定技术是Southern blot。提取待检动物组织的染色体消化后电脉，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果。 斑点杂交：提取动物DNA，点于硝酸纤维素膜，探针杂交，放射自显影。 聚合酶链式反应（PCR）：PCR扩增产物序列分析即可鉴定。 染色体原位杂交：（？）;目的基因的制备;目的基因的克隆 1.通过载体在适当的宿主中克隆 （1）基因克隆的载体 载体的选择与改造应具备： 提供在适当宿主细胞中复制的信号，或能整合到宿主 染色体上与基因组一起复制； 有增殖非必须的DNA区域，并含单个内切酶位点， 以便外源DNA共价连接（插入或取代该区段），形成重 组子可在宿主细胞内复制和增殖； 分子量不宜过大，以便于DNA体外操作； 载体DNA易与宿主核酸分开，便于提纯； 具有筛选标记，以区别阳性重组子和阴性重组子， 选择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型、形成 噬菌斑的能力等。 ;目的基因的克隆; 粘粒载体：由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成。由于噬菌体载体容量仍受一定限制，最大插入片段不能超过23kb。 粘粒载体：质粒复制起始位点、1个或多个限制性内切酶位点、抗药性标???、带有粘性末端的DNA片段。大小4~6kb，插入2945kb。;（2）目的基因与载体DNA间的连接 1）粘端连接反应方法 2）平断连接反应方法 （3）重组载体导入受体细胞 氯化钙转化法 2.通过PCR反应克隆目的细胞 在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 ;10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展 ;10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展 ;10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展 ;10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展;10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展;10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展;转基因动物研究的最新进展 1.? 转线粒体动物 2.? 逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵细胞 3.? 精子与外源基因合并注射卵母细胞;10.2.3 转基因动物应用面筋的问题;10.3 转基因生物反应器 ;10.3.1 转基因微生物反应器 ;10.3.2 转基因植物反应器 ;10.3.3 转基因动物反应器 ; 10.4 转基因技术存在的问题与最新进展; 10.4 转基因技术存在的问题与最新进展