NY/T 679-2003猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法.pdf

ICS 11.220 B 41 中华 人 民共 和 国农 业行 业标 准 NY/T679-2003 猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法 Enzymeimmunoassayforporcniereproductiveandrespiratorysyndrome 2003-07-30发布 2003-10-01实施 中华人民共和国农业部 发 布 NY/T679-2003 ol1 吕 本标准的附录A为规范性附录。 本标准山农业部畜牧兽医局提出并归日。 本标准起草单位 :农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人:土宏伟、王传彬、陈西钊、田克恭。 NY/T679-2003 猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)免疫酶试验和免疫酶组织化学方法。 本标准适用于检测猪血清中的猪繁殖与呼吸综合症病毒((PRRSV)抗体和组织中的PRRSV抗原 2 免疫酶试验 2.， 材料准备 2.1.1 试剂 2.1.1.1 磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章。 2.1.1.2 抗原涂片的制备:PRRSV接种于生长至70Y,-80%单层的Marc145细胞 接种后3d- 4d，病变达50%0 75%时，用胰蛋白酶消化分散感染的细胞单层,PBS洗涤三次后，稀释至1X700个细 胞/ml 取印有 10个一40个小孔的室玻片，每孔滴加 10阿 室温自然干燥后，冷丙酮(40C)固定 10min密封包装，置一20℃备用 2.1.1.3 标准阳性血清:PRRSV试验感染猪制备的血清。 2.1.1.4 标准阴性血清:无PRRSV感染、未经免疫的猪血清 2.1.1.5 酶结合物:辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球菌A蛋自(SPA) 2.1.1.6 底物溶液:配制见第A.2章。 2.1.2 器材 a) 普通光学显微镜; b) 印有10个一4。个小孔的室玻片; c)微量加样器，容量5川一50川 ; d) 37℃恒温培养箱或水浴箱. 2.1.3 样品 采集被检猪血液，分离血清 血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一300C 保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS作10倍稀释 2.2 操作方法 2.2.，取出抗原涂片，室温干燥后，滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清，每份血 清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，370C30min, 2.2.2 PBS漂洗三次，每次5min,室温干燥 2.2.3 滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，370C30mine 2.2.4 PBS漂洗三次，每次5min 2.2.5 将室玻片放人底物溶液中，室温下显色5min--10min.PBS漂洗两次，再用蒸馏水漂洗一次。 2.2.6 吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。 2.3 结果判定 2.3.1在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下:即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均 无色;阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判定结果;否则应 重试。 2.3.2 待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为PRRSV抗体阴性。 2.3.3 待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应硅棕黄色至棕褐色，即可判为 NY/T679-2003 PRRSV抗体阳性. 3 免疫酶组织化学法 3.1 材料准备 3.1.， 试荆 3.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第八.1章。 3.1.1.2 标准阳性血清 PRRSV实验感染猪制备的血清 3.1.1.3 标准阴性血清:无PRRSV感染、未经免疫的猪血清。 3.1.1.4 酶结合物 :HRP标记的SPA 3.1.1.5 底物溶液:配制见第A.2章