NY/T 680-2003禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法.pdf

ICS 11.220 R 41 中华 人 民共 和 国农 业 行 业标 准 NY/T680-2003 禽 白血 病 病 毒 p27抗 原 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 方 法 Enzyme-linkedimmunosorbentassay foravianleukosisvirusp27antigen 2003-07-30发布 2003-10-01实施 中华人民共和国农业部 发 布 NY/T680-2003 前 言 本标准的附录A为规范性附录 本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位:农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人:陈西钊、苏敬良、王宏伟、田克恭、吴清民、王传彬 NY/T680-2003 禽 白血 病 病 毒 p27抗 原 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 方 法 范围 本标准规定了禽白血病病毒(ALV)p27抗原酶联免疫吸附试验方法 本标准适用于检测鸡蛋蛋清以及鸡胚组织细胞培养物中的ALVp27蛋白抗原口 2 p27抗原酶联免疫吸附试验 2.1 试验材料 2.1.1 试剂 2.1.1.1 抗p27蛋白抗体:应用提纯的禽成髓细胞性白血病病毒p27蛋自免疫家兔制备。 2.1.1.2 阳性抗原:含鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的鸡蛋清 2.1.1.3 阴性抗原:无鸡白血病/肉瘤病毒群特异性p27蛋白抗原的SPF鸡蛋清。 2.1.1.4 酶结合物:辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋白抗体 2.1.1.5 磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章 2.1.1.6 包被液:配制见第A.2章 2.1.1.7 洗涤液:配制见第A.3章。 2.1.1.8 样品稀释液:配制见第A.4章 2.1.1.9 底物溶液:配制见第A.6章。 2.1.1.10 终止液:配制见第A.7章 2.1.2 器材 a) 酶联检测仪; b) 聚苯乙烯板; c) 微量加样器，容量50川^-200p工; d) 37℃恒温培养箱 2.1.3 样品 2.1.3.1鸡蛋样品:将待检鸡蛋小的一端朝上放置，打碎蛋壳，用移液器无菌吸取蛋清，密装于灭菌小 瓶内。 2.1.3.2 细胞培养物:用移液器无菌吸取细胞培养物，密装于灭菌小瓶内，10(或一30℃保存或立即送 检。试验前将送检样品统一编号，试验时不做稀释口 2.2 操作方法 2.2.1用包被液将抗p27蛋白抗体作4000倍稀释，每孔100川 加入96孔聚苯乙烯板中，4℃过夜。 2.2.2 取出包被好的聚苯乙烯板，将液体倒弃，每孔加250川_洗涤液漂洗三次，每次2min，甩干。 2.2.3 每孔加150阿_质量浓度为1%的明胶封闭液,37℃反应60min 2.2.4 重复2.2.2 2.2.5 在A,,A:孔各加100pL标准阴性对照，A,A 孔各加100川 标准阳性对照 2.2.6 将待检样品加人其他各孔，每个待检样本加两孔，每孔700川,370(_反应60min, 2.2.7 重复2.2.2e 2.2.8 每孔加 100沁 工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗p27蛋自抗体 37℃反应60mine NY/T680-2003 2.2.9 重复2.2.2 2.2.10 衍孔加 100川 新配制的底物溶液，室温，避光反应 10min 2.2.11 征孔加 100p1终止液口 2.2.12 置酶联检测仪于450nm测定各孔吸光度(OD)值。 2.3 结果判定 2.3.1 阻性对照 ()D均值等于(A,孔OD值+A:孔 ()D值)2;阳性对照OD均值等于(A:孔OD 值+A 孔 ()D值)/2 2.3.2 阴性对照O(D均值小于。.15，阳性对照OD均值减去阴性对照01)均值大于。