但对于进展期大肠癌患者 中国临床康复中国组织工程研究与临床康复ppt课件.pptVIP

逯晓波 中国医科大学公共卫生学院 ; 前言; ; ; NER过程涉及包括识别DNA损伤位点，切开受损的DNA链，合成并连接DNA链，以取代切除的寡核苷酸等，大约18-25个活性因子在其中发挥作用。; ; ; ; ;材料与方法;方法: 构建两种包含ERCC1 codon 118 SNP 的基因型T/T或C/C的质粒 总RNA提取及 cDNA合成 PSQTM DNA短序列分析ERCC1SNP基因型 ERCC1基因扩增及目的片段的回收 Gateway?定向克隆技术构建ERCC1表达载体 ;Gateway?定向克隆技术构建ERCC1表达载体示意图;2、不同ERCC1 SNP的表达载体转染UV20细胞 转染细胞可在含10% G418 的DMEM培养基选择 生长，次日调G418 浓度为5%，五日后，在荧光 显微镜下根据是否可见表达绿色荧光蛋白细胞， 确定是否转染成功及转染效率。 每次转染实验设立无DNA的空白对照组，以保 证实验结果的特异性 ;3 、蛋白提取及Westernblot检测ERCC1表达 获得3种稳定转染细胞系UV20-ERCC1(C/C)或 UV20-ERCC1(T/T)及UV20-GFP,聚丙稀凝胶电 泳法定性检测ERCC1蛋白表达 4 、 检测各转染细胞ERCC1mRNA水平 实时-定量PCR法 5、PSQTM DNA短序列确定转染细胞基因型 ;6、SRB法测定草酸铂的细胞抑制率 7、细胞克隆实验分析草酸铂细胞毒性 8、改良彗星实验检测草酸铂所致DNA损伤 9、Rad51免疫荧光实验评价草酸铂所致DNA损 伤及修复 ;结果;2、ERCC1在UV20细胞中的表达;3、Westernblot验证ERCC1在各细胞系中表达 ;4、转染细胞ERCC1的SNP确定 ;5、不同细胞ERCC1 mRNA水平比较 ;6、草酸铂的细胞抑制率测定及细胞克隆实验结果 ;图5， 各细胞草酸铂染毒后细胞克隆实验结果 ;图7，草酸铂染毒后细胞培养24h两种转染细胞彗星实验图象（╳100） ;7、 改良彗星实验测定各细胞DNA损伤修复程度 ;;图9，ERCC1不同SNPs转染细胞草酸铂处理后24h免疫荧光图象（╳100）;讨论;本研究下一步工作的重点将继续探讨ERCC1 8092CA多态对于ERCC1mRNA水平的影响、阐明ERCC1 8092CA对于ERCC1 codon 118 SNP的作用以及ASE-1的基因功能。