人心肌肌钙蛋白i和i-c复合物的原核表达及抗ctni单克隆抗体的制备-prokaryotic expression of human cardiac troponin i and i - c complex and preparation of monoclonal antibody against ctni.docxVIP

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2018-07-29 发布于上海
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人心肌肌钙蛋白i和i-c复合物的原核表达及抗ctni单克隆抗体的制备-prokaryotic expression of human cardiac troponin i and i - c complex and preparation of monoclonal antibody against ctni

暨南大学硕士学位论文暨南大学硕士学位论文万方数据万方数据摘要目的: 通过大肠杆菌 BL21 原核表达获得能够替代天然人源 cTnI 的蛋白产物，并用于 Balb/c 小鼠免疫，制备出高特异性高亲和力的抗人 cTnI 的单克隆抗体，为后续检测方法的建立奠定基础。方法: 人工合成目的基因 cTnI-linker-TnC，针对单体蛋白 cTnI 和 cTnC 的目的基因分别设计引物，通过 PCR 方法获得 cTnI 和 cTnC 的目的基因,然后分别构建重组大肠杆菌 BL21，可溶性表达目的蛋白 cTnI、cTnC 和 cTnI-linker-TnC,纯化鉴定后用 cTnI-linker-TnC 复合物和标准 cTnI 蛋白单体免疫六周龄 Balb/c 小鼠，通过经典的杂交瘤技术筛选分泌抗 cTnI 单抗的阳性杂交瘤细胞株，制备腹水型单克隆抗体并鉴定。结果: 成功的构建了三种目的蛋白（cTnI、cTnC 和 cTnI-linker-TnC）的重组表达菌株 BL21，并实现了高可溶性表达，对重组表达的目的蛋白 cTnI、cTnC 和 cTnI-linker-TnC 进行免疫原性鉴定，结果均具有很好的免疫原性，初步认为可以替代天然人源 cTnI 并用于后续免疫和检测。标准 cTnI 蛋白单体免疫并经细胞融合后成功的筛选到 8 株抗人 cTnI 的阳性杂交瘤细胞株，其中 6H7 和 4A8 的腹水型单抗效价可达 4 万。用原核表达的 cTnI-linker-TnC 免疫 Balb/c 小鼠，经细胞融合后的融合率为 100%且阳性率可达 30%，且原始孔细胞上清 OD 值超过 2.0 的克隆株有 18 株，进一步筛选工作正在进行之中。结论: 成功的实现了目的蛋白 cTnI、cTnC 和 cTnI-linker-TnC 的高可溶性原核表达，且很好的保持了免疫原性，可以用于后续检测和免疫，有望成为天然蛋白的替代物。成功的筛选到了抗人 cTnI 的阳性杂交瘤细胞株，并为后续检测方法的建立打下了基础。关键词: 人心肌肌钙蛋白；原核表达；单克隆抗体；杂交瘤 I ABSTRACT AIM: Prokaryotic expression of human cardiac troponin I (cTnI) and instead of the natural proteins. And using them to immune the Balb/c mouse, prepare several cTnI-specific monoclonal antibodies (mAbs) with high specificity and affinity, laying a foundation of cTnI detection method. METHOD: A short DNA sequence which codes 15 neutral amino acid residues was used to link cTnI and cTnC. And acquired the purpose genes of cTnI and cTnC through PCR technics .Then, the recombinant prokaryotic expression E.coli BL21 cells were constructed which contained the aim genes of cTnI, cTnC and cTnI-linker-TnC and expressed the purpose proteins. We used cTnI-linker-TnC and the natural cTnI to immunize the six week olds Balb/c mouse to prepare the mAbs of cTnI by using the classic hybridoma fusion method. Identified and analyzed the affinity and specificity of the ascites monoclonal antibodies. RESULTS: Constructed recombinant prokaryotic expression E.coli BL21 cells of purpose proteins cTnI, cTnC and cTnI-linker-TnC successfully and achieved the high soluble expression of them. An