融合蛋白tat-xiap的原核表达及其生物学活性的初步鉴定-prokaryotic expression of fusion protein ta t - x iap and preliminary identification of its biological activity.docxVIP

融合蛋白 TAT - XIAP 的原核表达及其生物学 活性的初步鉴定 中 文 摘 要 目的：体外合成 X 连锁调亡抑制蛋白(XIAP)基因编码区序列，将其插 入空载体 pTAT-HA 质粒，构建 pTAT-XIAP 原核表达载体，获得高产量、高 纯度的 TAT-XIAP 目的蛋白，蛋白复性后并研究融合蛋白 TAT-XIAP 的生物 学活性。方法：体外合成大鼠 XIAP 基因编码区序列，将其插入 pTAT-HA 质粒，构建重组表达载体 pTAT-XIAP，Nco I 和 Xho I 酶对 pTAT-XIAP 质 粒 DNA 进行双酶切并测序无误后，将 pTAT-XIAP 重组表达载体转入大肠 埃希氏菌（E.coli）表达菌株 BL21plysS。随机挑取阳性克隆的单菌落，接 种于含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37℃培养过夜，当 OD600=0.8-1 时， 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度 1mM，诱导 4h，聚丙烯 酰胺凝胶电泳（SDS）显示目的蛋白主要以包涵体的形式存在。进一 步优化表达条件，SDS及蛋白印迹法（western blot）鉴定目的蛋白 TAT-XIAP 的表达形式。取 TAT-XIAP 包涵体蛋白溶解于 8M 尿素 4℃过夜， 离心取上清加入镍离子亲和层析柱（Ni2+-NTA），在变性的条件下，用 20mM 和 50mM 咪唑溶液各 15mL 进行洗脱，100mM 咪唑溶液收集纯化的 TAT-XIAP 目的蛋白。SDS鉴定该蛋白的纯化效果。将纯化后的 TAT-XIAP 蛋白、10%甘油和 0.014mol/L 的 β-巯基乙醇装入透析袋，依次用 6M、5M、4M、2M、1M 尿素缓冲液和 PBS 4℃磁力搅拌进行透析，获得 了复性的 TAT-XIAP 融合蛋白。取 CEN2 对数生长期的细胞，不同浓度的融 合蛋白 TAT-XIAP 作用不同时间，MTT 法检测 TAT-XIAP 融合蛋白对 CEN2 细胞生长的影响。SD 大鼠腹腔注射复性后的 TAT-XIAP 融合蛋白，于注射 12h 后断头取大脑组织，冰冻切片，厚约 6μm，免疫荧光显微镜下观察 I II II TAT-XIAP 融合蛋白在脑组织的分布情况。结果：1.1%琼脂糖凝胶电泳结果 显示 pTAT-XIAP 质粒 DNA 约 4.5kb，pTAT-HA 质粒 DNA 约 3kb。pTAT-XIAP 质粒 DNA 经 NcoI/XhoI 酶切鉴定，电泳结果显示在 Marker 约 3kb 处可见 空载体 pTAT-HA 的条带，在 Marker 约 1.5kb 处可见 XIAP 的条带。 2.12%SDS结果显示 TAT-XIAP 目的蛋白分子量约 64kD，该蛋白主要 以包涵体的形式存在，经调整诱导温度、IPTG 浓度及诱导时间等进一步优 化诱导条件，发现 TAT-XIAP 目的蛋白仍主要以包涵体的形式存在。 TAT-XIAP 目的蛋白在变性条件下经镍离子亲和层析柱纯化，获得了高产 量、高纯度的 TAT-XIAP 目的蛋白。TAT-XIAP 融合蛋白经 SDS和 western blot 分析，在分子量约 64kD 处有一明显表达条带，实验结果与理论 结果相符。3.蛋白复性后，MTT 法检测 TAT-XIAP 融合蛋白对 CEN2 细胞 生长的影响，数据经统计学分析后，结果显示 TAT-XIAP 融合蛋白对 CEN2 细胞的生长有促进作用。4.免疫荧光结果显示 SD 大鼠脑组织中有大量绿色 荧光信号，其中以大脑皮质、基底节处多见。该蛋白主要分布在细胞浆中。 PBS 对照组除非特异性着色外，未见明显阳性绿色荧光信号。结论：1.成功 构建 pTAT-XIAP 原核表达载体并表达出目的蛋白。2.重组蛋白 TAT-XIAP 经镍离子亲和层析纯化，获得了高产量、高纯度的目的蛋白。3.重组蛋白 TAT-XIAP 复性成功，动物实验证实该蛋白可成功穿透血脑屏障，MTT 法 检测发现 TAT-XIAP 融合蛋白对 CEN2 细胞生长有促进作用，其作用机制有 待进一步研究。 关键词： X 连锁调亡抑制蛋白；融合蛋白；原核表达；生物学活性 III III EXPRESSION OF TAT-XIAP FUSION PROTEIN IN E.COLI AND ITS BIOACTIVE CHARACTERIZATION ABSTRACT Objective：To construct the prokaryotic expression vector containing XIAP and TAT gene,express recombinant TAT-XIAP fusion protein in E.coli with