基因功能研究的新技术ppt课件.pptVIP

;RNAi：基因功能研究的新技术;RNAi的定义;RNAi (RNA interference)Sequence-specific, post-transcriptional gene silencing mediated (PTGS) by double-stranded RNA RNA干涉是指双链RNA引起的序列特异性的转录后基因沉默; RNAi 广泛存在于从真菌到植物，从无脊椎动物到哺乳动物的多种生物体中，是一种自然存在的生物学现象。  目前，RNAi 已发展成为一种新的分子生物学实验技术，用于特异性地降低或关闭某些基因的表达。;RNAi的发现和研究历程; ; 1995年，Guo等在试图阻断线虫（C. elegans）中的par-1基因时，惊讶地发现给线虫注射正义RNA（sense RNA）同反义RNA一样，能特异性地抑制线虫par-1基因的表达，而未出现预期的正义RNA使基因表达增强的现象。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反，他们一直没能给这个意想不到的结果作出合理解释。 ;; 随后，dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所有真核生物中。这说明RNAi机制很可能是在进化的早期阶段就已经产生了。 ; 1999年，Hamilton 等在基因诱导的PTGS植株和病毒诱导的PTGS植株中，首次发现了长度为25nt 的RNA中间产物。 2000年，Zamore 和 Hammond 等在研究中发现，RNAi实验中加入的dsRNA被首先降解成21-23nt的小片段RNA（small interfering RNA，siRNA），随后在siRNA的引导下，由核酸内切酶将同源mRNA降解。 这一发现首次显示了dsRNA介导的基因沉默是一个同源依赖的两步降解反应。; 2000年，Wianny 和 Svoboda 等分别发现，在小鼠的早期胚胎和卵母细胞中dsRNA也能产生特异性的RNAi 效应。表明dsRNA在哺乳动物中也能诱导产生特异性的基因沉默，这为利用RNAi研究人类基因功能和基因治疗提供了崭新希望。 然而，对哺乳动物细胞而言，较长dsRNA诱导的RNAi作用不象它在其它真核生物中那样高效特异。因为较长的dsRNA（长度大于30nt）的导入可能与病毒侵入细胞相似，在哺乳动物细胞中可诱发细胞内 I 型干扰素（IFN-α，IFN-?），导致非特异性地降解mRNA，致使基因表达减少甚至细胞凋亡。 ; 令人振奋的是，在2001年 Elbashir SM 等克服了这一障碍，找到了一种在哺乳动物细胞中关闭特定基因的新方法，他们用合成的21nt 的siRNA (small interfering RNA)，成功地抑制了不同哺乳动物细胞（人胚肾293细胞、HeLa细胞）中的靶基因的表达，同时避免了对其他蛋白质合成的抑制。 从此RNAi 研究得以迅猛发展。 ; 用 RNAi 作关键词，在 PubMed 网上可以检索到 600 多篇文章 Cell 14篇 Nature 10篇 Science 13篇;? BREAKTHROUGH OF THE YEAR :Small RNAs Make Big Splash #1 The Winner ;RNAi as tool - companies;RNAi的作用机制和特征;;RNAi的作用特征;通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP) 合成dsRNA。己知的植物病毒基因组90％以上都是ssRNA，需要依靠病毒自身的 RdRP 进行复制。此外，异常的ssRNA（aberrant ssRNA）也可经RdRP合成dsRNA。 转座元件产生dsRNA。转座元件（TE）是基因组中基因座位可以移动的DNA序列。TE有2类：I 型TE是返转座元件，其通过RNA的逆转录进行扩增。I 型TE是植物TE中最主要的类型。II 型TE所有生物都有，以原核生物居多。 人工合成dsRNA。体外人工合成的一对序列互补的单链RNA（ssRNA），导入体内后在体内退火形成dsRNA形式，也可以在体外退火形成dsRNA形式，再导入体内。 构建表达dsRNA的质粒，转入细胞表达dsRNA。这为各类哺乳动物细胞基因功能的研究提供了强有力的工具。 ;RNAi的生物学功能;1. 抗病毒感染免疫 90％以上的植物病毒基因组为ssRNA，当侵入植物细胞时可形成dsRNA中间体。没有dsRNA的正常植物正是利用病毒自身产生的dsRNA而诱导RNAi 效应，选择性地降解外源性的