对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及VEGF的作用ppt课件.pptVIP

GM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及VEGF的作用中国医科大学实验病理学教研室 前 言 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)一直被认为是一种慢性进展的血管壁脂质沉积性疾病。近些年的研究逐渐阐明了炎症在AS病理过程中的重要作用。 炎症学说认为，炎症可导致不稳定斑块形成，斑块破裂甚至急性冠状动脉综合症（acute coronary syndrome, ACS）等临床严重并发症的发生。而不稳定斑块的重要特征之一就是斑块内血管新生。斑块内血管新生与斑块不稳定之间的关系已逐渐成为当前研究的热点。 血管新生是由既存的血管以出芽的方式形成新血管的过程，见于许多生理和病理情况。 血管新生的过程极其复杂，受到促进血管生成因子和抑制血管生成因子的共同调控。 AS斑块内的新生血管主要来自外膜血管滋养管（vasa vasorum）。 通过新生血管，血液中的血浆脂蛋白和大量炎细胞流入斑块内，加重炎症反应。 新生血管本身无平滑肌和周细胞支持，管壁薄弱，易于引起斑块内出血、斑块破裂甚至一系列临床严重并发症的发生。 实 验 目 的 研究炎性因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用。 探讨GM-CSF和VEGF与AS斑块稳定性及病变进展之间的关系。 实 验 方 法 原代培养HUVECs 应用Matrigel建立稳定的血管形成的体外培养体系。 Matrigel的用法： Matrigel冻存于-20℃，使用前置于4℃ 过夜，融化成黄色胶状液体。 根据本实验研究所得的经验：用预冷的微量进样器在短时间内迅速加入预冷的24孔板中，每孔80μl/cm2（厚度约为0.5mm）。轻轻摇晃培养板，使其铺平。最后将培养板放入37℃孵育箱内，30分钟后即可使用。 HUVECs原代培养: 采用本实验室改进的Jaffe氏培养法。取健康新生儿脐带（最好不超过12h），PBS冲洗干净，0.25%胰酶消化（37℃，5分钟），用含5%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，收集消化液。离心（1000转/分钟，10分钟）。弃上清，用含20%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，以5.0×105/cm2接种于涂有Matrigel的培养板内进行培养,24小时后换液。 实验分组 GM-CSF作用的检测 本实验根据不同的实验因素浓度和不同的作用时间，分别设计成浓度效应组和时间效应组。 浓度效应组：正常对照组（无血清DMEM培养液）、rhGM-CSF不同浓度组（25、50、100ng/ml），分别作用48h。 时间效应组：取相同浓度rhGM-CSF（100ng/ml）不同作用时间组（12、24、48h）。 VEGF作用的检测 正常对照组（无血清DMEM培养液）、rhGM-CSF（100ng/ml）组、rhGM-CSF（100ng/ml）+ VEGF165（10ng/ml）组，分别作用24h。 相差显微镜下观察各实验组血管腔形成情况。 各实验组用95%冰乙醇固定，4℃过夜 。用CD34免疫细胞化学方法（SP法）显示各组血管形态。 计数管腔数并进行统计学分析 每个实验组在40倍镜下选取3处血管密集的视野，100倍镜下计数每个视野的管腔数。应用SPSS、microsoft excel进行统计分析和处理。P0.05为有统计学意义。 实 验 结 果 Matrigel对体外培养人脐带静脉内皮细胞形成血管的诱导作用 本研究提示，应用Matrigel可在体外诱导培养的人脐带静脉内皮细胞形成管腔结构。内皮细胞在培养后18小时开始形成管腔结构，24小时即可建立稳定的血管形成的体外模型。 图1 在普通明胶上培养的人脐带静脉内皮细胞24小时形态， 内 皮细胞呈短梭形或多角形 ，达到亚融合（倒置相差显微镜x100） 图2 Matrigel诱导培养的人脐带静脉内皮细胞在24小所 建立的血管形成的体外模型（倒置相差显微镜x100） 图3 Matrigel诱导培养的人脐带静脉内皮细胞在24小时所建立 的血管形成的体外模型（CD34免疫细胞化学染色x100） 本研究提示，与在普通明胶上生长的内皮细胞相比，在Matrigel上生长的内皮细胞生长周期较短，并且细胞不发生融合，而是形成相互连接的毛细血管样的血管网络。细胞间界限不清。 不同浓度GM-CSF作用的检测 图4 正常对