血清白球蛋白的分离纯化及鉴定试验用课件.pptVIP

血清白蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定;目的要求;（一）分离纯化的意义;（二）分离纯化的要求;（三）分离纯化的一般程序;常用的蛋白质分离纯化技术; 一、盐析（中性盐沉淀）;盐析的基本原理;;;中性盐的选择;2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有 的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。;分段盐析;色 谱 法 chromatography;;;二．特点;;1、吸附色谱法 2、分配色谱法 3、离子交换色谱法 4、凝胶色谱法 5、亲和色谱法;二、脱盐（凝胶层析法）;超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质;凝胶层析;原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。; 离子交换色谱（ion exchange chromatography）;阳离子交换剂（cation exchanger）;离子交换剂的化学成分;阳离子交换基;阴离子交换基;阳离子交换层析过程;球蛋白中： α及β球蛋白的pI＜6.5，带负电 而γ球蛋白的pI＞6.5(pI7.3) ，带正电 γ球蛋白先洗脱出来。 白蛋白中： α、β及白蛋白均带负电，挂于柱上 先用低盐洗去α、β球蛋白 再用高盐竞争洗下白蛋白;操 作;洗脱液中蛋白质及盐分的检查;二、G-25凝胶层析脱盐;3、开下端出口，使样品进入凝胶床（刚好下降到凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量pH6.5的0.02mol/L NH4Ac缓冲液。 4、放开，流速约20滴/分钟，立即收集并检测， 20％磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，10滴/管。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。 5、 BaCl2检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。 6、平衡再生：继续洗脱30ml。 7、白蛋白样品脱盐。 15滴/管收集;三、纯化（阴离子交换层析）;四、醋酸纤维素薄膜电泳检查;　　 以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动，由于迁移率不同而被分离。; ;（1）血清 （2）粗分的γ-球蛋白液 （3）粗分的白蛋白液 （4）纯化的γ-球蛋白液：由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位置（2次），每次点样时待干后再点。 （5）纯化的白蛋白液;影响电泳速度的因素;结果分析;