色谱法原理5课件.pptVIP

10.3 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography，HPLC ; 1．与经典液相色谱法比较 Comparison with classic LC ;2．与气相色谱法比较 Comparison with GC ; (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 ;10.3.2 高效液相色谱仪 Instrumentation of HPLC;液相色谱仪 Liquid chromatograph;流 程 Procedures;高压输液系统: 由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵:又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。 在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵:保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。;往复泵原理示意图;2．进样系统 Injection system ;;3 分离系统——色谱柱 Separation system: HPLC column ;常用分离柱;4．检测系统 Detection system ; ;紫外可见光、电化学检测器的流通池比较;1. 紫外检测器 Ultraviolet detector;1a.紫外光电二极管阵列检测器 UV photodiode array detector;;光电二极管阵列检测器;2. 荧光检测器 fluorescence detector;3. 示差折光检测器 differential refractive index detector;示差折光检测器光路;（－）固定相 Stationary phases 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、???状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。 ;1. 表面多孔型固定相;2．全多孔型固定相 ; ;（二）流动相 Mobile phases ;;（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～IOOnm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 (5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离. ;10.3.4 HPLC的主要类型 Main types of HPLC; ;化学键合固定相类型;化学键合固定相的特点;3．流动相 mobile phase 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。 ;（二）化学键合相色谱法（CBPC） ;2．键合固定相的制备 （l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应： ≡Si－0H＋R