单克隆抗体制备技术--李会强.pptVIP

* 制备脾细胞 * 培养筛选骨髓瘤细胞 SP2/0细胞为肿瘤细胞，易发生突变丧失酶的缺陷； 为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8-AG(8氮鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变； * 培养筛选骨髓瘤细胞 + 8 - Azaguanine Myeloma Cells HGPRT- Myeloma Cells * 培养筛选骨髓瘤细胞 使用对数生长期细胞，融合前进行换液，确保细胞处于最佳状态。 培基：RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％ 。 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞 。 * 细胞融合 FUSION PEG MYELOMA CELLS SPLEEN CELLS HYBRIDOMA CELLS ELISA PLATE Feeder Cells Growth Medium HAT Medium Plating of Cells in HAT selective Medium Scanning of Viable Hybridomas * 细胞融合 杂交瘤技术中最为关键一步； 融合前亲本细胞需经预处理； 融合37℃水浴中进行； 注意两种亲本细胞的比例； 选择高质量细胞融合剂； 缓慢终止融合作用； * 关于“PEG” 分子量1500-3000 道尔顿； 诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合； 不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同； 应用浓度为50%； * 挑选阳性克隆 细胞生长至一定数量后便可进行； 方法应敏感、简单、重复性好； 方法： RIA、 ELISA、FIA； * 挑选阳性克隆 ELISA是常用技术之一 * 克隆化 将阳性克隆与其它克隆分开的过程。 克隆化应及早进行，以防止阳性克隆丢失。方法有： 显微操作法 有限稀释法 软琼脂法 * 应用有限稀释法进行克隆化 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 * 细胞鉴定 特异性 Ig类与亚类 中和活性 染色体核型 识别抗原表位 亲和力 * 大量制备抗体 体外细胞培养 腹腔内培养 * 大量制备抗体 腹腔内培养 * 实验流程 体外细胞培养 * 实验流程 注意： 阳性细胞克隆的冻存与复苏 单克隆抗体的优缺点 问题四: * 单克隆与多克隆比较 Derived from different B Lymphocytes cell lines POLYCLONAL. MONOCLONAL. Derived from a single B cell clone Batch to Batch variation affecting Ab reactivity titre mAb offer Reproducible, Predictable Potentially inexhaustible supply of Ab with exquisite specificity Enable the development of secure immunoassay systems. NOT Powerful tools for clinical diagnostic tests 抗体库技术简介 问题四: * 噬菌体抗体库简介 * 噬菌体抗体库简介 单克隆抗体制备技术 临床免疫学教研室 李会强 教授 * 何谓单克隆抗体？ 单克隆抗体（ monoclonal antibody，McAb）是指由单个杂交瘤细胞增殖而成的细胞克隆产生的，针对某一抗原表位的、完全均一的、单一特异性的抗体。 * 单克隆抗体的出现对医学发展的影响 单克隆抗体具有很高特异性，增加检测方法的特异性； 单克隆抗体具有均一性，推动商品化试剂盒出现和发展； 单克隆抗体出现推动T细胞亚群研究； 单克隆抗体推动生物制药领域的发展； 制备单克隆抗体的理论基础 问题一: * 克隆选择学说 1857年，FM Burnet提出克隆选择学说。指出：每个B淋巴细胞表面的抗原受体只识别一种抗原表位，并产生针对该决定簇的抗体。 * 克隆选择学说 * 克隆选择学说 淋巴细胞不能在体外长期存活 * 杂交瘤技术 杂交瘤细胞继承两个亲本细胞特性 * 杂交瘤技术的创始人 * 杂交瘤技术 1984 荣获诺贝尔生理医学奖 杂交瘤技术是制备抗体的技术革命 杂交瘤技术的基本原理 问题二: * 两个基本问题 选择亲本细胞与细胞融合 应用选择培基与杂交瘤细胞筛选 * 亲本细胞之一：免疫脾细胞 被抗原致敏的B淋巴细胞，可分化为浆细胞并分泌免疫球蛋白； 单一B细胞克隆表达一种抗原受体，识别并结合一种抗原表位，分泌单一特异性抗体； * 亲本细胞之一：免疫脾细胞 采用BALB/c小鼠 * 亲本细胞之二：骨髓瘤细胞 选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株； 能与B细胞杂交形成稳