用同尾酶切BamHIBclIBglII.PPT

第一节 DNA的体外重组 　三、DNA体外连接应注意的事项 　　2. DNA插入的方向正确 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。 用双酶切 EcoRI BamHI EcoRI BamHI EcoRI BamHI 第一节 DNA的体外重组 　三、DNA体外连接应注意的事项 　　3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入 　（2）起始密码 　　　尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATGGAATTC T 重组 但移码突变！ 第一节 DNA的体外重组 　三、DNA体外连接应注意的事项 　　4. 防止载体自身环化连接 　（1）提高插入片断的用量 　　　　连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 　（2）用碱性磷酸酶处理载体 　　　载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 第一节 DNA的体外重组 　四、载体和外源DNA插入片段的连接结果 1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 第一节 DNA的体外重组 * 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 * 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 * 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 第六章 DNA重组的操作 第一节 DNA的体外重组 第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术 第三节 重组子的筛选和鉴定 外源DNA 载体DNA 重组分子 原核细胞 真核细胞 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 受体细胞 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 一、黏性末端的连接 二、平末端的连接 三、PCR产物的连接 四、Gateway载体构建系统 第一节 DNA的体外重组 重组DNA 重组DNA是来源不同的DNA在体外结合在一起从而形成的新的DNA分子Recombinant DNA 形成重组DNA的目的有三个： (i)形成新的蛋白产物 (ii)形成多拷贝的基因 (iii) 插入外源基因片段到新的物种中从而赋予其新的特性 一、重组DNA的概念和目的 第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 　1. 粘性末端连接（由同一种酶或同尾酶产生末端） 第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 　1. 粘性末端连接 （1）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接 　　使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 　1. 粘性末端连接 　（2）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 HindIII EcoRI HindIII EcoRI 对载体酶切 HindIII EcoRI 　对基因酶切 质粒载体的定向重组 第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 　2. 平头末端连接 　（1） 直接连接 　　　5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 　　　T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ -OH -OH -P -P P- P- HO- HO- 5’ 3’ -OH -P P- HO- 5’ 3’ 3’ 第一节 DNA的体外重组 非酶切位点 二、外源基因与载体的连接 　2. 平头末端连接 　（2） 人工加尾形成 “粘性末端” 　　 a）同聚加尾 法 第一节 DNA的体外重组 第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 　2. 平头末端连接 　（2） 人工加尾形成 “粘性末端” b）衔接物(linker)连接 　　　Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 　　linker的作用：用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 GGAATTCC CCTTAAGG EcoRI linker： 第一节 DNA的体外重组