离子交换层析课件.ppt

;离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组份离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。;flash;;在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。;各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个动态平衡的过程。结合的强度与离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等有关。 ;蛋白质等生物大分子与离子交换剂的结合和它们的性质及pH有较大关系。 两性电解质 等电点(pI): 缓冲液pHpI时，蛋白质带正电 缓冲液pHpI时，蛋白质带负电 ;;■ 离子取代优先顺序 Pecking Order：;离子交换剂的电荷基团（功能基团）;阴离子交换剂的电荷基团带正电，可交换阴离子物质。根据电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。 结合季胺基团（-N(CH3)3），如季胺乙基（QAE）为强碱型离子交换剂，结合叔胺（-N(CH3)2）、仲胺（-NHCH3）、伯胺（-NH2）等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基（DEAE）为弱碱型离子交换剂。;交换容量;■ 不同胶体的吸附容量有很大差异：;影响交换容量的因素很多，主要可分为两个方面。 一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组份的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组份进行作用的有效表面积。样品组份与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组份进入，这样样品组份与离子交换剂作用面积大。 小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，小分子可以自由进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。 较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。;另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组份和离子交换剂的带电性质。 pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小。 pH影响样品组份的带电性。对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的pH以使样品组份能充分地与离子交换剂交换、结合。 一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组份洗脱下来。;柱效;■ pH 与 分 辨 率;离子交换基质的种类和性质 ;■ 胶体的组成与外型：;离子交换剂的选择、处理和保存;其次是对离子交换剂基质的选择。 聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。 纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。一般纤维素离子交换剂价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化有较大改变，影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。 ;离子交换纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）和CM-纤维素（羧甲基纤维素）最常用，在生物大分子物质（蛋白质，酶，核酸等）的分离方面显示很大的优越性。 一是它具有开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大； 二是它具有亲水性，对蛋白质等生物大分子物质的吸附不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，不致引起生物大分子物质的变性和失活。 三是它的回收率高。 离子交换纤维素已成为非常重要的一类离子交换剂。 ;离子交换层析的基本操作;装柱;离子柱的平衡;平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，可以去除大量的杂质。使得洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。 在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组份有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是 H＋或 OH－离子，因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用 H＋或 OH－型离子交换剂，因为分离过程中 H＋或 OH－离子被置换出来都会改变层析柱内pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。; 离子交换层