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生物化学实验Ⅰ 实验一 糖的制备、定性及含量分析（4课时） 一、 实验目的 1. 学会糖的制备； 2. 利用糖的呈色反应来粗略的定性糖类； 3. 糖的含量测定 4. 学会使用分光光度计。 二、 实验原理 还原糖溶于水，非还原糖被酸水解后一般也溶于水，故可用水提取。而原料中的蛋白质可用调PH值的方法除去或用沉淀剂，糖的进一步纯化可采用乙醇沉淀糖。 糖的呈色反应有：Molisch反应、Fehling反应、Benedict反诉反应等多种呈色反应。可粗略的定性，较精确则是TCL（单糖，多糖需水解）、GC、HPLC、IR、UV、GC/HPLC－MS来定性。本实验用Molisch反应粗略的定性。 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、 实验材料、主要仪器和试剂 1． 实验材料 小麦面粉或罗望子；精密pH试纸。 2． 主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11 （2）大离心管：50mL×2 （3）烧杯：100mL×1 （4）三角瓶：100mL×1 （5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1 （7）恒温水浴锅 （8）沸水浴 （9）离心机 （10）电子天平 （11）分光光度计 3． 试剂 （1）1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。 （5）6M HCl和6M NaOH各100mL。 （6）Molisch试剂：α－萘酚2g溶于95%乙醇并定容100ml，现配现用 （7）冰醋酸、亚硫酸氢钠 四、 操作步骤 1．罗望子多糖的制备工艺流程如下； 2．罗望子多糖的制备步骤 (1)原料的处理：先将罗望子种子外层红褐色的种皮用机械或化学方法除净，然后用粉碎机将白色的种仁粉碎至60一80目，得到白色的罗望于种仁粉。 (2)煮沸：取10g种仁粉，加入30倍的清水，充分搅拌均匀(为了防止加水后种仁粉结团，可先加入少量水，先将种仁粉调成糊状，然后再加入剩余的水)，用冰醋酸溶液调 节pH值，使水溶液的pH值控制在4．2—5．6之间，搅拌加热至微拂，煮沸20一30min，得到一粘稠的浆状液。 (3)静置沉降；在浆状液中加入原体积50％的热水稀释浆状液，搅拌均匀后静置沉 淀8—12h，让浆状液中的蛋白质颗粒等杂质充分沉降。或用离心机离心5min,5000r. (4)分离过滤：将静置沉降后的上清液抽出，下层混思浆状液用离心或压滤的方法分离除去沉降物，合并上清液和滤液，得到乳白色浆液。 (5)浓缩：在乳白色浆液中加入少量NaOH稀溶液，将其PH值回调至中性，再加入少量亚硫酸氢钠溶液漂白，然后加热浓缩至粘稠的半流体状时停止加热。 (6)烘干粉碎，将粘稠的半流体浆倒入白色浅瓷盘中，放入干燥箱中在70℃一80℃的温度下进行热风干燥，即得到片状罗望子多糖，最后用粉碎机将片状的罗望子多糖粉碎，即可得到灰白色的粉状罗望子多糖。 3、糖的定量 （1）． 制作葡萄糖标准曲线 取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 0 1 2 3 4 5 6 1mg/mL葡萄糖标准液 （mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水 （mL） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS （mL） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 葡萄糖含量 （mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 光密度值 （OD540nm） 将各管摇匀，在沸水浴中准确加