无血清处理对甲状腺癌 tt 细胞内s100a13及fgf-1释放机制的初步分析-preliminary analysis of release mechanism of s100a13 and fgf - 1 in tt cells of thyroid cancer treated with serum-free treatment.docxVIP

无血清处理对甲状腺癌 tt 细胞内s100a13及fgf-1释放机制的初步分析-preliminary analysis of release mechanism of s100a13 and fgf - 1 in tt cells of thyroid cancer treated with serum-free treatment.docx

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无血清处理对甲状腺癌 tt 细胞内s100a13及fgf-1释放机制的初步分析-preliminary analysis of release mechanism of s100a13 and fgf - 1 in tt cells of thyroid cancer treated with serum-free treatment

南华大学学位论文原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包 含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名: 年 月 日 南华大学学位论文版权使用授权书 本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有 权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论 文的全部或部分内容,可以编入有关数据库进行检索,可以采用复印、 缩印或其它手段保留学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规 定送交学位论文。对于涉密的学位论文,解密后适用该授权。 作者签名: 导师签名: 1年 月 日 年 月 日 1 2目 录 2 一、中文摘要1 二、英文摘要3 三、主要缩略语及英文索引5 四、论文正文6-29 前言 6 实验材料8 实验方法11 实验结果18 实验讨论26 实验结论29 五、参考文献30 六、综述34 七、硕士期间发表的文章44 八、致谢45 PAGE PAGE 10 无血清处理对甲状腺癌 TT 细胞内 S100A13 及 FGF-1 释放机制的初步研究 研究生 杨井金 导 师 文 芳教授 曹仁贤教授 中 文 摘 要 目的:探讨无血清处理对甲状腺癌 TT 细胞内 Ca2+的浓度([Ca2+]i)变化及 S100A13、FGF-1 蛋白释放的影响,初步阐明 Ca2+在 S100A13、FGF-1 蛋白释放过 程中的作用。 方法:采用 Western-Blot 检测无血清处理 0h、1h、2h、4h、6h 细胞内 S100A13 及 FGF-1 蛋白表达量,ELISA 检测培养上清 FGF-1 蛋白浓度。应用激光共聚焦显 微镜实时动态检测无血清处理 TT 细胞 1h[Ca2+]i 的变化。间接免疫荧光观察 BAPTA-AM(2.5μmol/L)、EGTA(2.5mmol/L)对无血清处理 6h 细胞 S100A13、 FGF-1 蛋白荧光分布的影响,Western-Blot 检测 S100A13、FGF-1 蛋白表达量, ELISA 检测培养上清 FGF-1 蛋白浓度。 结果:Western-Blot结果显示无血清处理0h、1h、2h、4h、6h细胞S100A13、 FGF-1蛋白表达量有逐渐下降趋势,0h、1h、2h组间比较无明显差异,4h组细胞 S100A13、FGF-1蛋白表达与0h、1h、2h三组比较差异有统计学意义(P0.05), 6h组细胞S100A13、FGF-1蛋白表达与0h、1h、2h、4h组差异有统计学意义(P0.01)。 上述各时间处理组培养上清ELISA结果显示,0h、1h、2h、4h、6h组细胞培养上 清中FGF-1浓度有上升的趋势,4h组与0h、1h、2h三组比较差异有统计学意义 (P0.05),6h组培养上清中FGF-1浓度较0h、1h、2h、4h组明显升高(P0.01)。 激光共聚焦Ca2+荧光显像结果显示:正常培养的TT细胞[Ca2+]i约0.1~0.3μmol/L, 在扫描期间较稳定;无血清处理23min内保持相对稳定,23min后细胞[Ca2+]i迅速 上升达到最大值1.6μmol/L,维持17min左右第40min缓慢下降至一个较低水平, 第40min至第60min[Ca2+]i接近0.3~0.6μmol/L。1h内细胞平均[Ca2+]i明显高于 正常培养组(P0.05)。EGTA、BAPTA-AM能明显抑制无血清处理引起的细胞[Ca2+]i 升高,平均[Ca2+]i与正常培养组差异无统计学意义。 湖南省自然科学基金资助项目(No,06jj5046,No.05jj30039) 间接免疫荧光结果显示无血清处理 6h 细胞内 S100A13、FGF-1 蛋白荧光强度 较正常培养组明显减弱;EGTA、BAPTA-AM 能拮抗无血清处理引起这两种蛋白荧 光变弱。Western-Blot 结果显示无血清处理 6h 细胞 S100A13、FGF-1 蛋白表达 量较正常培养组明显低,无血清处理同时加入 EGTA、BAPTA-AM 时细胞这两种蛋 白表达量与正常培养组无明显差异;上述各组细胞培养上清 ELISA 结果显示无血 清处理 6h 组培养上清中 FGF-1 浓度较其它 3 组明显增高(P0.01)。 结论:Ca2+可能与无血清处理对甲状腺癌 TT 细胞内 S100A13 及 FGF-1 的释放 有关;Ca2+螯合剂 EGTA、BAPTA-AM 能有效拮抗无血清处理引起的 TT 细胞[Ca2+]i 升高,并抑制 S1

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