胃癌中fra-1 vegf-c表达的关联性及临床意义-correlation and clinical significance of fra - 1 vegf - c expression in gastric cancer.docxVIP

PAGE PAGE 10 血管再生。许多恶性肿瘤在确诊时已经发生了转移，而肿瘤组织丰富的新生血管 淋巴管是肿瘤细胞转移的基础。在肿瘤新生淋巴管形成的影响因素中 ,最有效和 特异的因子就是VEGF-C。血管内皮细胞生长因子－C是第1个被发现淋巴管生长因 子。由Joukov等[11] 以F l t4 亲和层析方法从人前列腺癌pc-3的CDNA文库中克隆分 离出的。其有促进血管和淋巴管生成作用，参与生理性、病理性淋巴管新生。VEGF-C 蛋白过度表达与一些肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移密切相关[12-14] 材料与方法 1 材料 收集 2009 年 1 月至 2009 年 8 月蚌埠医学院病理科常规病理学证实的 50 例胃 癌患者的组织标本，每例均有详实的临床资料、手术记录，术前均未接受放疗和 化疗。患者年龄 28 岁～77 岁，中位年龄 52.5 岁；病理类型为腺癌或差分化癌。 所用标本的临床病理资料见表 1。同时选取 30 例距肿瘤边缘 5cm 以上的正常组织 作为对照。 表 1 胃癌临床病理资料 性别 年龄 肿瘤长径 特征 例数 男 31 女 19 ≥60 27 ＜60 23 ≥4 30 ＜4 20 淋巴结转移 侵润深度 分化程度 TNM 分期 原发部位  阳性 36 阴性 14 T1＋T2 21 T3＋T4 29 高分化+中分化 26 差分化+未分化 24 Ⅰ＋Ⅱ 20 Ⅲ＋Ⅳ 30 贲门部 18 胃体部 9 胃窦部 23 2 主要试剂与仪器设备 二) 免疫组织化学法检测胃癌组织中 Fra-1+VEGF-C 蛋白 1. 主要仪器设备 （1）TSJ-Q 型自动封闭式组织脱水机：常州市中威电子仪器厂。 （2）PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪：常州市中威电子仪器厂。 （3）Sakura 组织包埋机：日本制造。 （4）LEICARM2235 型石蜡切片机：德国制造。 （5）101－2 型电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂。 （6）HPC-1001 不锈钢高压锅：福州迈新生物技术开发有限公司。 （7）OlympusBX50 生物显微镜：日本制造。 （8）OlympusBX50 照相显微镜：日本制造。 （9）高精度加液器：德国 EPPENDORF 公司。 （10）吸头：加拿大 BBI 公司。 （11）BOX1003 孵育盒：福州迈新生物技术开发有限公司。 （以上设备均来自蚌埠医学院病理教研室） 2. 试剂制备及来源 （1） 兔抗人 Fra-1 多克隆抗体：美国 Santa Cruz 公司产品。 （2） 兔抗人 VEGF-C 多克隆抗体（MAB-0243） 福州迈新生物技术开发有限公 司 （3） EliVisionTM plus KIT-9903（A、B）检测试剂盒 福州迈新生物技术开发公 司 A 即用型酶标抗鼠或兔聚合物增强剂/即用型酶标抗羊聚合物增强剂 B 即用型酶标抗鼠或兔聚合物/即用型酶标抗羊聚合物 （4） 液体 DAB（二氨基联本胺）酶底物显色试剂盒（福州迈新生物技术开发公司） DAB-solution A(20x)：3ml DAB-solution B(20x)：3ml DAB-solution C(20x)：3ml （5） 多聚-L 赖氨酸 福州迈新生物技术开发公司 （6） PBS 缓冲液 蚌埠医学院病理科配制 （7） 封片 注（6）（7）由蚌埠医学院病理教研室资助。 3. 实验方法及步骤 （1） HE 染色 ① 切片脱蜡至水洗： 二甲苯Ⅰ 2min 二甲苯Ⅱ 2min 二甲苯Ⅲ 2min 无水乙醇Ⅰ 1min 无水乙醇Ⅱ 1min 无水乙醇Ⅲ 1min 95%乙醇 1min 85%乙醇 1min 75%乙醇梯度脱水 1min 自来水冲洗 2min 蒸馏水冲洗 2min ② 染色： 苏木素液 5min 自来水洗 1min 1%盐酸乙醇分化 3sec 自来水洗反蓝 30min 蒸馏水水洗 1min 1%醇溶性伊红染液 2min ③ 脱水、透明、封固： 70%乙醇 1min 80%乙醇 1min 90%乙醇 1min 95%乙醇 1min 无水乙醇 1min 无水乙醇 1min 二甲苯Ⅰ 1min 二甲苯Ⅱ 1min 中性树胶封固 （2） 免疫组化染色 采用免疫组织化学 EliVision 法检测 VEGF-C 和 Fra-1,具体步骤如下： ① 载玻片的处理 载玻片在重铬酸钾溶液中浸泡 24 小时，用流水冲洗 24 小时 后，置 60℃温箱中烤干，以 10%多聚-L-赖氨酸溶液浸泡数秒，沥干，置 60℃温箱 中烤干备用。 ② 将置备好的石蜡块做成厚度均为 4μm 的石蜡切片，60℃恒温箱烤蜡。 ③ 石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后，用 PBS（PH7.4）冲洗三次，每 次 3～5 分钟。 ④ 每张切片加一